マイクロRNA

Apr 18, 2023

寄生虫とベクター 16 巻、記事番号: 184 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

住血吸虫症は、肝臓の線維化や死につながる可能性がある、重篤だが無視されている人間の寄生虫症です。活性化肝星細胞 (HSC) は、肝線維症中の細胞外マトリックス (ECM) タンパク質の蓄積を促進する主要なエフェクターです。異常な microRNA-29 発現は線維性疾患の発症に関与しています。しかし、日本住血吸虫（S. japonicum）誘発性肝線維症における miR-29 の役割についてはあまり知られていません。

マイクロRNA-29a-3p（miR-29a-3p）およびRoundaboutホモログ1（Robo1）のレベルを、S.japonicum感染中の肝臓組織で調べた。 miR-29a-3p-Robo1 シグナル伝達経路が関与している可能性があることが判明しました。我々は、MIR29A条件付きノックインマウスとmiR-29a-3pアゴミルを注射したマウスを使用して、住血吸虫症誘発性肝線維症におけるmiR-29a-3pの役割を調査した。肝線維症および HSC 活性化における miR-29a-3p-Robo1 シグナル伝達の機能的寄与を、初代マウス HSC およびヒト HSC 細胞株 LX-2 を使用して調査しました。

MiR-29a-3p は住血吸虫誘発性線維症のヒトおよびマウスでダウンレギュレートされ、Robo1 は肝臓組織でアップレギュレートされました。 miR-29a-3p は Robo1 を標的とし、その発現を負に制御しました。さらに、住血吸虫症患者における miR-29a-3p の発現レベルは、線維症の重症度を表す門脈および脾臓の厚さの直径と高度に相関していました。さらに、本発明者らは、miR-29a-3pの効率的かつ持続的な上昇が住血吸虫誘発性肝線維症を逆転させることを実証した。特に、我々は、miR-29a-3pがHSCのRobo1を標的にして、感染中のHSCの活性化を防ぐことを示した。

我々の結果は、HSCにおけるmiR-29a-3p-Robo1シグナル伝達経路が肝線維症の発症に重要な役割を果たしているという実験的および臨床的証拠を提供する。したがって、我々の研究は、住血吸虫症および他の線維性疾患の治療介入としての miR-29a-3p の可能性を強調しています。

住血吸虫症は、最も蔓延しているにもかかわらず無視されている熱帯感染症の 1 つであり、78 か国の 2 億 3,000 万人以上が罹患しており、その中には子供や若者も含まれます [1]。ヒトの肝疾患を引き起こす 2 つの最も重要な種は、マンソン住血吸虫と日本住血吸虫 (S. japonicum) です [2]。日本住血吸虫症の主な病理は、卵誘発性の肉芽腫形成と線維症です。宿主の腸間膜静脈に生息する雌成虫は多数の卵を産み、そのほとんどが門脈系を介して肝臓組織に捕捉され、肉芽腫反応と線維症を引き起こします[3]。肝線維症とその結果として生じる門脈圧亢進症は、この慢性疾患に関連する死亡の主な原因です[4]。肝線維症を引き起こすメカニズムの解明は、住血吸虫症やさまざまな線維性疾患に対するより効果的な介入戦略につながる可能性があります。

肝星細胞 (HSC) は、住血吸虫感染による肝線維症 [6] を含む、さまざまな種類の肝線維症 [5] の主なエフェクターです。静止型 HSC は、肝細胞と類洞内皮細胞の間の内皮下腔に位置する類洞周囲細胞であり、これらの細胞は細胞質ビタミン A 液滴の存在を特徴としています [7]。 HSC は活性化されると、増殖性、収縮性、線維形成性の筋線維芽細胞に徐々に変化します [8]。肝損傷はさまざまなサイトカインや成長因子を刺激し、HSCを活性化してα-平滑筋アクチン（α-SMA）を生成し、過剰な細胞外マトリックス（ECM）を分泌させ、肝線維症を引き起こします[9、10]。住血吸虫感染は、卵誘発性肉芽腫の周囲に分布する HSC を活性化することが示されています [11]。以前の研究では、トランスフォーミング成長因子-β1（TGF-β1）が住血吸虫誘発性肝線維症のエフェクターサイトカインであり、依然としてHSCの活性化を促進する古典的な線維形成サイトカインであることが示唆されている[12、13、14]。 HSC の活性化を阻止することは、肝線維症の治療介入の主要な戦略の 1 つとなっています [15]。

マイクロRNA（miRNA）は、標的メッセンジャーRNA（mRNA）の3'非翻訳領域との塩基対形成によって遺伝子発現を負に制御する内因性の小さな非コードRNAです[16、17]。 miRNA が正常な状態および病気の状態下で細胞の恒常性を維持する上で重要な役割を果たすことを示す証拠が増えています [18]。 miRNA 発現の調節不全は、血管系 (肺線維症)、肝臓、腎臓などの複数の臓器系の線維症に関与しています [19、20、21、22]。いくつかの研究では、miRNA が肝線維症の発症において重要な役割を果たしており、有用な治療標的である可能性があることが示されています [23、24]。我々の以前の発見は、miR-182の発現増加がFOXO1を標的とすることによってHSC活性化を促進し、その結果肝線維症が誘導されることを示した[25]。 miR-29 ファミリーは miR-29a、miR-29b、miR-29c で構成されており、ヒト肝線維症および胆管結紮 (BDL) によって誘発される肝損傷の 2 つの異なるモデルで実証されているように、線維化肝臓ではこれらが大幅に減少しました。四塩化炭素 (CCl4) [22、26、27]。しかし、miR-29a が住血吸虫感染誘発性肝線維症の発生または進行に関与していることを示す実験的証拠はありません。

Roundabout ホモログ 1 (Robo1) は、受容体の神経細胞接着分子ファミリーのメンバーであり、さまざまな細胞型で発現されます [28、29]。 Robo1 は、細胞の増殖、分化、遊走などの複数の生物学的プロセスにおける重要な制御因子です [30、31]。 Robo1 は、いくつかの種類の癌 [32、33] や、腎臓病 [34] や肝線維症 [35] などの慢性疾患に関連しています。我々の以前の結果は、microRNA-29a-3p (miR-29a-3p) が Robo1 の発現を下方制御し、肝細胞癌細胞の増殖、移動、浸潤、腫瘍進行、転移を阻害することを示しました [36]。これらの発見を踏まえて、我々は miR-29a-3p と Robo1 が住血吸虫症誘発性肝線維症に決定的に関与しているという仮説を立てました。本研究では、miR-29a-3p と Robo1 の役割を調査するためにヒトとマウスで S. japonicum を使用しました。私たちは、MIR29A 条件付きノックインマウスと miR-29a-3p アゴミルを注射したマウスを使用して仮説を調査し、住血吸虫への曝露によるヒトとマウスの肝臓の線維化変化における miR-29a-3p と Robo1 の分子病因経路を解明しました。感染。

肝生検標本は、2015年9月から2019年8月まで、華中科技大学同済医科大学同済病院から採取された。肝臓の正常部分からの楔状生検標本は、転移性肝癌のない患者7名（結腸癌3名、結腸癌3名、結腸癌3名）から採取された。 4 つの胃癌）を対照として。慢性住血吸虫症患者9名から線維化肝臓標本が採取されました。組織の病状は病理組織学的診断によって確認された。研究の除外基準は、薬物またはアルコールの使用に関連する他の種類の肝炎および肝疾患を患っている患者でした。特に明記しない限り、n 値は組織を採取した患者の数を指します。組織サンプルの数が限られているため、すべてのサンプルがすべての研究プロトコルに含まれているわけではありません。登録患者の人口統計的特徴を表 1 にまとめます。

CRISPR/Cas9 によるヒト MIR29A コンディショナルノックインマウス株の作製は、Cyagen Biosciences (蘇州、中国) に委託されました。マウスは、C57BL/6J 遺伝的背景に基づいて作成されました。 Hipp11 (H11) 遺伝子座への gRNA (5'-GAACACTAGTGCACTTATCCTGG-3')、「CAG-loxP-Stop-loxP-human MIR29A-polyA」カセットを含むドナーベクター、および Cas9 mRNA を受精マウスに同時注入しました。卵を使用して、ターゲットを絞った条件付きノックイン子孫を生成します。ターゲティング戦略の概略図を追加ファイル 1: 図 S1 に示します。

この研究では生後 6 週間の雌マウスを使用しました。野生型 (WT) C57BL/6J マウスは、Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (北京、中国) から入手しました。ヒト MIR29A 条件付きノックインマウスは、Cyagen によって構築されました。すべての動物は、病原体のない特定の条件下で、標準的な実験室用の餌と水が自由に利用できる状態で飼育されました。感染を誘発するために、7 匹の 6 週齢雌 MIR29A マウスと 7 匹の年齢を一致させた雌 WT C57BL/6J マウスを、南京研究所から購入した感染した Oncomelania hupensis カタツムリから得た 16 ± 1 個の S. japonicum cercariae (中国本土株) に経皮的に曝露しました。住血吸虫症の予防と管理（中国、南京）。年齢と性別を一致させた7匹の非感染マウスを対照として使用した。

miR-29a-3p が卵誘発性肝線維症を逆転させるのに十分であるかどうかを判断するために、miR-29a-3p アゴミル (RiboBio、広州、中国) を使用しました。 miR-29a-3pアゴミルおよびネガティブコントロール(NC)アゴミルを製造業者の指示に従ってリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解し、PBSで最終浴濃度10nmol/500μlまで希釈した。感染マウスは、感染後 6 週間で寄生虫を死滅させるために 300 mg/kg のプラジカンテルを 2 日間連続して経口投与し、マウスには miR-29a-3p アゴミルまたは NC アゴミルを 1 匹あたり 10 nmol の用量で投与しました。 28日間、4日ごとに尾静脈を介して500μlのPBSを投与した。さらなる分析のために、感染後 10 週間でマウスを採取しました。

卵負荷を推定するために、各肝臓 0.2 g を 20 ml の 4% 水酸化カリウムで一晩消化し、顕微鏡下で卵の数を数えました。肝臓中の 1 グラムあたりの総卵数は、次の式を使用して計算されました: 計算された卵の数 × 5。肝臓または脾臓の指数は、次の式で計算されました: (マウス肝臓または脾臓の総重量 / マウス体の総重量) × 100% [12、37、38]。卵肉芽腫のサイズは、以前に記載されているように、校正された測定接眼レンズを使用して Mayer の H&E 切片で測定され、線維症の程度は切片のマッソントリクローム染色によって評価されました [12]。総線維症スコアは、各肉芽腫の密度と面積を乗算することによって決定されました (最大スコアは 16)。肝臓中のヒドロキシプロリン含有量は、メーカーの指示に従って比色アッセイキットを使用して検出されました(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute、南京、中国)。

眼球摘出によりマウスから約 1 ml の血液を採取しました。血液を室温で 4 時間インキュベートして血餅を形成させ、その後遠心分離 (3500RPM、10 分間) して血清を血餅から分離しました。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）の血清レベルは、Siemens Advia 1650自動分析装置を使用して測定されました。

肝臓を最初に、0.05% コラゲナーゼ IV 型を用いて、37 °C で 30 分間振盪しながら in situ で消化しました。得られた細胞懸濁液を５０×ｇで３分間遠心分離することによって肝細胞を単離し、５０×ｇで２分間遠心分離することによって精製した。肝細胞をペレット化した後、非実質細胞を含む上清を450×gで8分間遠心分離した。 HSCは、1450×gで20分間、15％（w/v）および11.5％（w/v）イオジキサノール勾配（OptiPrep; Stemcell Technologies、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア、カナダ）を使用して非実質細胞から単離されました。 HSCをさらに精製するために、ビオチン結合抗CD271抗体（Miltenyi Biotec、ベルギッシュグラードバッハ、ドイツ）および抗ビオチンMicroBeads（Miltenyi Biotec）を使用して、HSCからクッパー細胞（KC）を除去しました。純度は > 97%、生存率は > 95% でした。 HSC の精製の代表的な結果を追加ファイル 2: 図 S2 に示します。

LX-2 は、ヒト HSC 由来のよく特徴付けられた細胞株であり、これらの細胞は武漢大学 (中国) の細胞収集センターから入手されました。初代HSCおよびLX-2細胞をプラスチックプレートに播種し、10％ウシ胎児血清（FBS; Gibco、Gaithersburg、MD、USA）および100μg/mlペニシリンを添加したDMEM（Gibco、Gaithersburg、MD、USA）で培養しました。ストレプトマイシン（Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）。細胞培養は、5% CO2 の加湿インキュベーター内で 37 °C に維持されました。

LX-2 細胞 (2.5 × 105 細胞/ウェル) を、組換え TGF-β1 (PeproTech) の存在下または非存在下で 6 ウェルプレートに播種しました。 in vitro で miR-29a-3p の効果を確認するために、LX-2 細胞に外因性 hsa-miR-29a-3p (miRBase: MIMAT0000086) をトランスフェクトしました。以前に記載されているように、riboFECT™ CP Transfection Kit (RiboBio、広州、中国) を使用して、細胞に 50 nM miR-29a-3p 模倣物、100 nM miR-29a-3p 阻害剤、またはそれらのネガティブコントロールをトランスフェクトしました [39]。簡単に説明すると、10 × riboFECT™ CP バッファーを 1 × に希釈しました。トランスフェクションシステムは、1 × riboFECT™ CP バッファー、riboFECT™ CP 試薬、およびミミック (50 nM) または阻害剤 (100 nM) の混合物であり、その混合物を LX-2 細胞にトランスフェクトしました。トランスフェクションの 48 時間後、各実験グループの細胞を再懸濁して収集し、下流の実験に供しました。

ヒトおよびマウスの肝臓サンプルを 4% パラホルムアルデヒドで 24 時間固定し、パラフィンに包埋し、厚さ 4 μm の切片に切り出しました。免疫組織化学では、ホースラディッシュペルオキシダーゼ (HRP) 結合二次抗体 (PeproTech Inc.、米国) を次の一次抗体による免疫染色に使用しました: ウサギポリクローナル抗 Robo1 (1:50、ab7279、Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国)、ウサギポリクローナル抗コラーゲン I (1:100、14695-1-AP、ProteinTech、シカゴ、イリノイ州、米国)、およびウサギモノクローナル抗α-SMA (1:500、ab108424、Abcam)。免疫蛍光染色では、組織切片を Robo1 (1:50、ab7279、Abcam)、α-SMA (1:200、BM0002、Boster Biological Technology、武漢、中国)、およびデスミン (1:100、ab227651) に対する一次抗体とともにインキュベートしました。、Abcam)、続いて Alexa Fluor 594 および Alexa Fluor 488 結合二次抗体 (1:200、Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国) とインキュベートしました。細胞核を視覚化するために、すべての切片を1μg/mlの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI; Sigma-Aldrich)で染色した。各グループには少なくとも 3 つの肝臓切片が含まれていました。染色された切片を顕微鏡 (Nikon Eclipse Ci) で観察し、高解像度デジタルカメラ (Nikon デジタルサイト DS-FI2) を使用して画像を撮影しました。

メーカーのプロトコールに従って、TRIzol試薬(Invitrogen)を使用して全RNAを単離した。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) は、以前に記載されているように実行されました [40]。 Robo1、Col1α1、Col3α1、α-SMA、および TGF-β1 の発現レベルは、SYBR Green Master Mix Kit (Takara、草津、日本) を使用して測定されました。 miR-29a-3p の発現レベルは、Bulge-Loop miRNA qRT-PCR スターターキット (RiboBio、広州、中国) を製造業者のプロトコールに従って使用して測定しました。 U6 および miR-29a-3p の配列特異的プライマーは、RiboBio (広州、中国) によって合成されました。この研究における内因性コントロールは U6 snRNA および GAPDH であり、2-ΔΔCt 法を使用してすべての mRNA および miR-29a-3p の発現の変化倍数を計算しました。ヒトおよびマウスのプライマー配列を表 2 に示します。

総細胞タンパク質を、新たに添加したプロテアーゼ阻害剤（Boster Biological Technology、中国、武漢）の存在下、RIPA 溶解バッファー（Beyotime Biotechnology、中国、上海）を用いて氷上で抽出し、BCA アッセイ（Pierce、クラムリントン、英国）によって定量しました。合計 30 μg/レーンのタンパク質抽出物を 10% PAGE (Beyotime Biotechnology、上海、中国) で分離し、続いて PVDF 膜 (Millipore Corp.、米国マサチューセッツ州ビレリカ) に転写しました。非特異的結合は、TBST 中の 5% 無脂肪乳でブロックされました。膜をウサギ抗Robo1 (1:1000、ab7279、Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州) とともに4℃で一晩インキュベートしました。膜を HRP 結合抗ウサギ二次抗体とさらにインキュベートし、増強化学発光 (ECL; Abbkine, Redlands, CA, USA) を使用して検出しました。ウサギ抗 GAPDH (1:2000、10494-1-AP、ProteinTech、シカゴ、米国) を内部標準として使用しました。濃度測定は、ImageJ ソフトウェアを使用して実行されました。

実験結果は平均値±標準偏差（SD）で表されます。実験群間の統計的有意性は、両側スチューデント t 検定およびテューキー補正を備えた一元配置分散分析を使用して評価されました。患者からの臨床結果は中央値と四分位範囲として表されます。ほとんどの患者変数の分布が歪んでいるため、マン-ホイットニーの U 検定とダンの多重比較事後検定を備えたクラスカル-ウォリスが適用されました。カテゴリデータの場合、χ2 検定またはフィッシャーの直接確率検定を実行して、グループ間の差異を決定しました。スピアマンのランクテストを相関関係に使用しました。すべての統計分析は、GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software、米国カリフォルニア州ラホーヤ) または SPSS 25.0 (SPSS、イリノイ州シカゴ) を使用して実行されました。 P 値 < 0.05 は有意であるとみなされました。

肝臓標本における miR-29a-3p と Robo1 の発現を調べるために、慢性住血吸虫症患者と対照患者で肝生検を実施しました。線維化した肝臓組織では、より大きな線維化領域とより多くのコラーゲンの沈着があり、住血吸虫症患者の肝臓標本切片では日本住血吸虫の卵が観察されました（図1A）。線維症群における miR-29a-3p のレベルは対照群よりも有意に低く、Robo1 mRNA のレベルは増加していました (図 1B、C)。イムノブロットを分析し、Robo1 転写レベルを確認しました (図 1D、E)。 Robo1 の機能的効果をさらに評価するために、肝組織内の Robo1 を免疫組織化学によって分析しました。線維化組織は、対照肝組織よりも強い Robo1 染色を示し、Robo1 陽性細胞は主に炎症および線維化の領域に局在していました (図 1F)。免疫蛍光染色を使用して、Robo1 の発現と HSC の存在を検出しました。HSC は、さまざまなタイプの肝線維症における主要なエフェクター細胞であり、肝炎症を線維形成に結び付ける際に重要な役割を果たします。 Robo1 と HSC の共局在が、特に住血吸虫症患者の肝臓で観察されました (図 1F)。さらに、住血吸虫症患者における miR-29a-3p および Robo1 のレベルと門脈の直径および脾臓の厚さとの間に有意な相関があることがわかりました（図 1G–J）。これらのデータは、miR-29a-3p と Robo1 が住血吸虫誘発性肝線維症の進行に関与している可能性を示唆しました。

住血吸虫症患者の肝組織では miR-29a-3p 発現が減少し、Robo1 発現が増加しました。患者から採取した肝臓組織のパラフィン包埋切片を、H&E、マッソントリクローム、およびシリウスレッドで染色しました。スケールバー、200μm。 B、C miR-29a-3p および Robo1 発現レベルの qPCR 分析のために全 RNA を抽出しました。対照 (n = 7)、線維症 (n = 9)。 D、E Robo1 の発現はウェスタンブロット法によって測定されました。画像濃度は ImageJ を使用して定量化し、GAPDH に正規化しました。 F 肝臓切片における Robo1 の代表的な免疫組織化学染色および Robo1 (緑) と α-SMA (赤) の共局在の免疫蛍光染色が検出されました。黄色の矢印は陽性細胞を示します。スケールバー、50μm。 G–J 住血吸虫症患者における miR-29a-3p および Robo1 の mRNA レベルと門脈直径および脾臓の厚さとの相関関係 (n = 9)。 I 大きな点は 2 人の患者からのデータを示します。データは中央値および四分位範囲 (B、C、および E) として表示されます。すべてのデータは少なくとも 2 つの独立した実験の代表です。有意性は、Mann-Whitney U 検定 (B、C、および E) または Spearman の順位検定 (G-J) を使用して計算されました。 *P < 0.05、***P < 0.001。 miR-29a-3p: マイクロRNA-29a-3p; Robo1: ラウンドアバウトホモログ 1

ジャポニクム感染後の様々な時点でマウスから肝臓サンプルを収集した。 TargetScan データベース (www.targetscan.org) によって予測されているように、Robo1 は miR-29a-3p の潜在的な標的です。 miR-29a-3p と Robo1 の関係を分析するために、肝住血吸虫症の進行中のそれらの発現を評価しました。我々は、miR-29a-3pの発現が感染後6週間で肝臓で減少し始め、8週目と12週目に最低レベルに達することを発見した（図2A）。対照的に、Robo1 の発現レベルは感染後 8 週間で大幅に上昇しました (図 2B ～ D)。さらに、miR-29a-3p の下方制御は、感染マウスの単離肝細胞および HSC で主に観察されました (図 2E)。また、qPCR によりさまざまな肝細胞型における miR-29a-3p の相対発現を分析したところ、miR-29a-3p は非感染肝臓の肝細胞や KC ではなく、主に単離された初代 HSC に存在することがわかりました。 miR-29a-3pの発現レベルは、肝細胞およびKCと比較して、感染肝臓からのHSCにおいて有意に下方制御されていた(図2F)。また、Robo1 の免疫化学染色を実行し、Robo1 産生細胞が主に卵肉芽腫の周囲に位置していることを観察しました (図 2G)。免疫蛍光二重染色により、Robo1 と α-SMA の共局在が明らかになり (図 2G)、活性化 HSC が in vivo で Robo1 を発現していることが示されました。 HSC における miR-29-3p の発現は感染後 6 週間で減少し始めましたが、この時点で Robo1 mRNA レベルは増加しました (図 2H、I)。さらに、スピアマン相関分析により、miR-29a-3pとRobo1発現の間に負の相関が観察されました（R = - 0.8301、P < 0.0001;図2J）。総合すると、これらの結果は、感染した肝臓内の活性化された HSC が Robo1 の供給源であり、Robo1 が HSC における miR-29a-3p の潜在的な標的であることを示唆しています。

マウス住血吸虫症における miR-29a-3p および Robo1 発現の分析。 A、B 感染時の肝臓サンプルにおける miR-29a-3p および Robo1 の発現は qPCR によって検出されました (n = 4 ～ 5)。 C、D Robo1 タンパク質はウェスタンブロッティングによって測定され、ImageJ を使用して定量され、GAPDH に対して正規化されました (n = 6)。 E、F 初代肝細胞 (Heps)、クッパー細胞 (KC)、および肝星細胞 (HSC) を非感染および感染 (感染後 8 週間) の肝臓から単離し、miR-29-3p のレベルを qPCR によって測定しました。 (n = 3)。 G 肝臓切片における Robo1 の代表的な免疫組織化学染色および Robo1 (緑色) と α-SMA (赤色) の共局在の免疫蛍光染色が検出されました。黄色の矢印は陽性細胞を示します。スケールバー、50μm。 H、I 初代 HSC を肝臓組織から単離し、HSC における miR-29a-3p および Robo1 の発現を qPCR によって検出しました (n = 4)。 J マウスの HSC における Robo1 と miR-29a-3p の mRNA レベル間の相関関係 (n = 20)。データは、2 つの独立した実験からの平均 ± SD として表示されます。有意性は、両側スチューデント t 検定 (A、B、D、E、H、および I)、または 2 つのグループ間の比較のための Tukey 補正を伴う一元配置分散分析 (F)、またはスピアマンの順位検定 (J) によって決定されました。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001、0W サンプル (A、B、D、H、および I) と比較。 miR-29a-3p: マイクロRNA-29a-3p; Robo1: ラウンドアバウトホモログ 1; Heps: 肝細胞。 KC: クッパー細胞。 HSC: 肝星細胞。 ns: 重要ではありません

私たちの以前の研究では、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを使用して、Robo1 が miR-29a-3p の直接の標的であることを実証しました [36]。本研究は、肝線維化の進行における典型的な線維化促進遺伝子である TGF-β1 による LX-2 細胞の刺激により、miR-29a-3p の mRNA 発現が下方制御され、Robo1 mRNA のレベルが上方制御されることを示しました（図 3A）。、B）。さらに、miR-29a-3p 模倣体または阻害剤を LX-2 細胞にトランスフェクトし、qPCR およびウェスタンブロッティングによって miR-29a-3p および Robo1 のレベルを定量しました。予想通り、miR-29a-3p は miR 模倣グループでは上昇し、miR 阻害剤グループでは減少しました (図 3C)。 mRNA レベルとタンパク質レベルの両方で、miR-29a-3p の上昇により Robo1 の発現が明らかに減少し、miR-29a-3p の枯渇により Robo1 の発現が有意に増加しました（図 3D–F）。総合すると、これらのデータは、Robo1 が HSC における miR-29a-3p の直接の標的であることを示しています。

miR-29a-3p と Robo1 の関係の検証。 A、B LX-2 細胞を 10 ng/ml TGF-β1 に 48 時間曝露し、miR-29a-3p および Robo1 の発現を qPCR によって検出しました (n = 3)。 C-F LX-2 細胞をプラスチックプレート上で培養し、50 nM miR-29a-3p 模倣物、100 nM miR-29a-3p 阻害剤、またはそれらのネガティブコントロール (NC) を 48 時間トランスフェクトしました。 miR-29a-3p と Robo1 の発現は、qPCR (n = 3) (C、D) およびウェスタンブロッティング (n = 3 ～ 4) (E、F) によって決定されました。データは平均値 ± SD として表示されます。すべてのデータは少なくとも 3 つの独立した実験の代表です。有意性は両側スチューデント t 検定 (A ～ D、F) によって決定されました。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。 miR-29a-3p: マイクロRNA-29a-3p; Robo1: ラウンドアバウトホモログ 1

肝線維症の病因に対する miR-29a-3p-Robo1 シグナル伝達の影響を評価するために、ヒト MIR29A コンディショナルノックインマウスにおける S. japonicum 誘発肝線維形成モデルを確立しました。 WT マウスはコントロールと同じ治療を受けました。 WT マウスと比較して、MIR29A マウスは心臓 (約 2.0 倍)、肝臓 (約 1.8 倍)、脾臓 (約 3.2 倍)、腎臓 (約 2.2 倍) で miR-29a-3p のレベルが高かった。 ) (追加ファイル 3: 図 S3)。肝臓および脾臓サンプルの形態学的変化は、感染WTマウスと比較して、S.japonicum感染MIR29Aマウスにおいて中程度の肉芽腫性反応および脾腫を示した(図4A)。これらの結果は、マウス血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）のレベルの低下によって確認され、肝臓および脾臓の指数によってさらに確認されました（図4B〜E）。注目すべきことに、ヒドロキシプロリン定量（図４Ｆ）、マッソントリクローム染色、およびシリウスレッド染色（図４Ａ、ＧおよびＨ）によって示されるように、日本住血吸虫に感染したＭＩＲ２９Ａマウスは、ＥＣＭ沈着の有意な減少を示し、そして顕著な減少を示した。 H&E 染色により視覚化された肝肉芽腫のサイズの縮小 (図 4A、I)。線維症の減少は、免疫組織化学的染色および感染マウスの肝臓における線維症関連遺伝子発現の qPCR ベースの定量化によってさらに確認されました。コラーゲン I および α-SMA の免疫組織化学的染色、および Col1α1、Col3α1、α-SMA、および TGF-β1 mRNA の量は、S. japonicum に感染した MIR29A マウスでは、感染した WT マウスと比較して顕著に減少しました（図 4A、J） –M）。ただし、2つの感染グループ間で卵負荷に有意な変化はなく、miR-29a処理が寄生虫の繁殖と生存に影響を与えないことが示されました（追加ファイル4：図S4A）。

MIR29A マウスは、住血吸虫感染中に肝臓損傷や線維症を発症しにくくなりました。 MIR29A マウスと WT マウスに 16 個の日本住血吸虫セルカリアを経皮感染させるか、未感染のまま放置しました。肝臓および脾臓のサンプルを感染後 10 週間で採取しました。非感染群と感染群の両方における MIR29A マウスと WT マウスの肝臓と脾臓のマクロ写真。スケールバー、1cm。 H&E、肝臓切片のマッソントリクロームおよびシリウスレッド染色、ならびにコラーゲン I および α-SMA の免疫組織化学的染色。スケールバー、50μm。 B、C 肝臓および脾臓の指数を測定しました (n = 7)。 D、E 血清 ALT および AST レベルを測定しました (n = 7)。 F ヒドロキシプロリン含量として測定された肝臓のコラーゲン含量 (n = 7)。 G 肝臓切片のマッソントリクローム染色から測定された線維症スコア (n = 7)。 H シリウスレッド染色陽性の領域は、IPP ソフトウェアを使用して測定されました (n = 7)。 I 肉芽腫のサイズは、H&E 染色された肝臓切片から測定されました (n = 7)。 J-M 感染時の肝臓における Col1α1、Col3α1、α-SMA、および TGF-β1 の発現は qPCR によって検出されました (n = 7)。データは、3 つの独立した実験の平均 ± SD として表示されます。多重比較は、2 つのグループ (BM) 間の比較に対する Tukey の補正を伴う一元配置分散分析によって実行されました。 **P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001、感染 WT サンプルと比較。 miR-29a-3p: マイクロRNA-29a-3p; Robo1: ラウンドアバウトホモログ 1; ALT: アラニンアミノトランスフェラーゼ。 AST: アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ

次に、これらのマウスの Robo1 レベルを評価しました。 Robo1 mRNA発現は、非感染群および感染群のWTマウスよりもMIR29Aマウスの肝臓組織で有意に低かった(図5A)。ウェスタンブロット法で測定したところ、S. japonicum に感染した MIR29A マウスの肝組織では、感染した WT マウスと比較して Robo1 タンパク質が減少していました。非感染 MIR29A マウスグループは、非感染 WT マウスグループと比較して Robo1 発現のわずかな減少を示しましたが、その差は統計的に有意ではありませんでした (図 5B、C)。次に、miR-29aの過剰発現が住血吸虫症誘発性HSC活性化を妨げるかどうかを調べました。我々はマウスから初代HSCを単離し、免疫蛍光染色に基づいて、感染したマウス肝臓組織のHSCがin vivoでRobo1を発現していることを発見した。さらに、感染したWTマウスと比較して、感染したMIR29AマウスではRobo1の蛍光強度が減少した(図5D)。 MIR29A マウスの感染 HSC では、WT マウスと比較して、Col1α1、Col3α1、α-SMA、および TGF-β1 mRNA の量が著しく減少しました（図 5E-H）。これらの結果は、miR-29a の過剰発現が Robo1 の発現を低下させ、住血吸虫症による HSC 活性化を防止することを示唆しました。

MIR29A マウスは、住血吸虫感染時の HSC 活性化をよりよく防ぐことができました。 A 肝臓における Robo1 の発現レベルは qPCR によって測定されました (n = 7)。 B、C Robo1 タンパク質はウェスタンブロッティングによって測定され、ImageJ を使用して定量され、GAPDH に対して正規化されました (n = 6)。 D-H 初代 HSC はマウスの肝臓組織から単離されました。 D 初代 HSC における Robo1 (緑色) と α-SMA (赤色) の共局在の代表的な免疫蛍光染色が検出されました。挿入図は、輪郭が描かれた領域を高倍率で示しています。スケールバー、50μm。 E – H 感染中の初代HSCにおけるCol1α1、Col3α1、α-SMA、およびTGF-β1の発現はqPCRによって検出されました（n = 7）。データは、2 つの独立した実験からの平均 ± SD として表示されます。有意性は、2 つのグループ (A、C、E ～ H) 間の比較に対する Tukey の補正を使用した一元配置分散分析によって決定されました。 ##P < 0.01、非感染 WT サンプルと比較。 **P < 0.01、****P < 0.0001、感染 WT サンプルと比較。 miR-29a-3p: マイクロRNA-29a-3p; Robo1: ラウンドアバウトホモログ 1

miR-29a-3pが卵誘発性肝線維症の逆転に寄与したかどうかを検証するために、マウスを中程度の用量の寄生虫に感染させた。肝線維症が明確に現れた感染後 6 週間目に、すべての感染マウスをプラジカンテルで処理して寄生虫を死滅させた後、miR-29a-3p アゴミル、NC アゴミル、または PBS を 28 日間 4 日ごとに注射し、28 日間剖検しました。感染後 10 週間 (図 6A)。 miR-29a-3pアゴミル処置群からの肝臓および脾臓サンプルは、中程度の肉芽腫性反応および脾腫を示した(図6B)。抗線維症治療は、肝臓および脾臓の指数を有意に低下させた(図6C、D)。さらに、miR-29a-3pアゴミルで処置したマウスは、ALTおよびASTの循環レベルの有意な低下を示し、処置が肝細胞損傷を軽減したことを示唆した(図6E、F)。 miR-29a-3p アゴミルを投与されたマウスは、ヒドロキシプロリン定量 (図 6G)、マッソントリクローム染色、およびシリウスレッド染色 (図 6B、H、および I) によって示されるように、ECM 沈着の大幅な減少を示し、顕著な減少を示しました。 H&E 染色で可視化された肝肉芽腫のサイズの縮小 (図 6B、J)。しかし、肝臓は、3つの感染グループ間で卵負荷に有意な変化を示さなかった(追加ファイル4:図S4B)。一貫して、代表的な免疫組織化学的染色と qPCR 分析により、miR-29a-3p アゴミルで処理したマウスの肝臓における線維症マーカーの発現レベルの低下が実証されました (図 6B、K-N)。

miR-29a-3pアゴミルを介したmiR-29a-3pの上昇は、住血吸虫誘発性肝線維症を部分的に逆転させた。マウスに16個の日本住血吸虫セルカリアを経皮的に感染させたか、あるいは感染させずに放置した。感染後6週間で、感染マウスをプラジクアンテルで処理して寄生虫を死滅させた後、miR-29a-3pアゴミル、NCアゴミル、またはPBSを28日間4日ごとに投与した。感染後 10 週間でマウスを剖検した。寄生虫感染、抗寄生虫薬または miR-29a-3p アゴミルの投与、およびサンプル回収のタイムスケジュール。 B 非感染マウス、感染マウス、および miR-29a-3p アゴミルで処理した感染マウスの肝臓および脾臓のマクロ写真。スケールバー、1cm。肝臓切片の H&E、マッソントリクローム、およびシリウスレッド染色、およびコラーゲン I および α-SMA の免疫組織化学的染色。スケールバー、50μm。 C、D 肝臓および脾臓の指数を測定しました (n = 3 ～ 5)。 E、F 血清 ALT および AST レベルを測定しました (n = 5)。 G 肝臓のコラーゲン含有量はヒドロキシプロリン含有量によって決定されました (n = 4 ～ 5)。 H 肝臓切片のマッソントリクローム染色から測定された線維症スコア (n = 5)。 I シリウスレッド染色陽性の領域は、IPP ソフトウェアを使用して測定されました (n = 5)。 J H&E 染色肝臓切片から測定された肉芽腫サイズ (n = 5)。 K–N 感染時の肝臓における Col1α1、Col3α1、α-SMA、および TGF-β1 の発現は qPCR によって検出されました (n = 4)。データは、3 つの独立した実験の平均 ± SD として表示されます。多重比較は、2 つのグループ (C ～ N) 間の比較に対して Tukey の補正を使用した一元配置分散分析によって実行されました。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。 miR-29a-3p: マイクロRNA-29a-3p; Robo1: ラウンドアバウトホモログ 1; ALT: アラニンアミノトランスフェラーゼ。 AST: アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ

予想どおり、miR-29a-3p アゴミルで処理した感染マウスでは、NC アゴミルおよび PBS グループと比較して miR-29a-3p 発現の有意な上昇が観察され（7.2 ～ 9.9 倍）（図 7A）、その結果、 qPCR およびウェスタンブロッティングによって決定されたように、Robo1 発現は著しく減少しました (図 7B–D)。 MIR29A マウスと同様に、感染マウスの肝臓では Robo1 と α-SMA+ HSC の共局在が検出されました。一方、miR-29a-3pアゴミルで処理した感染マウスのHSCにおけるRobo1発現は、NCアゴミルまたはPBSで処理した感染マウスよりも低かった(図7E)。 Col1α1、Col3α1、α-SMA、および TGF-β1 の mRNA レベルも、miR-29a-3p アゴミルで処理したマウスの感染 HSC で下方制御されました (図 7F-I)。総合すると、これらのデータは、miR-29a-3p の上方制御により Robo1 発現が減少し、住血吸虫症による HSC 活性化が防止されることを実証しました。

miR-29a-3pアゴミルを介したmiR-29a-3pの上昇は、住血吸虫感染時のHSC活性化を妨げた。 A、B 肝臓における miR-29a-3p および Robo1 の発現レベルは qPCR によって測定されました (n = 3 ～ 4)。 C、D Robo1 タンパク質はウェスタンブロッティングによって決定され、ImageJ を使用して定量され、GAPDH に対して正規化されました (n = 3)。 E-I 初代 HSC はマウスの肝臓組織から単離されました。 E 初代 HSC における Robo1 (緑色) と α-SMA (赤色) の共局在の代表的な免疫蛍光染色。スケールバー、100μm。 F – I 感染時の初代HSCにおけるCol1α1、Col3α1、α-SMA、およびTGF-β1の発現はqPCRによって検出されました（n = 3-4）。データは、2 つの独立した実験からの平均 ± SD として表示されます。有意性は、2 つのグループ (A、B、D、F ～ I) 間の比較に対する Tukey 補正を使用した一元配置分散分析によって決定されました。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。 miR-29a-3p: マイクロRNA-29a-3p; Robo1: ラウンドアバウトホモログ 1

次に、miR-29a-3pがTGF-β1誘発性HSC活性化を妨げるかどうかを調査しました。十分に検証された不死化ヒト HSC 細胞株 (LX-2) を使用して、miR-29a-3p の過剰発現が LX-2 細胞における Col1α1、Col3α1、α-SMA、および TGF-β1 の mRNA レベルを大幅に低下させることを発見しました。 TGF-β1 の存在下 (図 8A ～ D)。さらに、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐは、ＴＧＦ－β１の存在下でＬＸ－２細胞においてＲｏｂｏ１を著しく下方制御したものを模倣する（図８Ｅ、Ｆ）。これらの結果は、miR-29a-3p 過剰発現が in vivo および in vitro の両方で Robo1 経路を阻害することにより HSC 活性化を減弱させることを実証しました。

miR-29a-3p の過剰発現は、Robo1 経路を阻害することにより HSC 活性化を弱めました。 LX-2 細胞を 50 nM miR-29a-3p 模倣物またはそのネガティブコントロールで 6 時間前処理し、TGF-β1 (10 ng/ml) を培地に添加し、その後線維症マーカーと Robo1 の発現レベルを測定しました。 48時間のインキュベーション。 A〜E LX-2細胞におけるCol1α1、Col3α1、α-SMA、TGF-β1、およびRobo1の発現はqPCRによって検出されました（n = 3〜6）。 F Robo1 タンパク質はウェスタンブロッティングによって測定され、ImageJ を使用して定量され、GAPDH に対して正規化されました (n = 4)。データは、3 つの独立した実験の平均 ± SD として表示されます。多重比較は、2 つのグループ (A ～ F) 間の比較に対して Tukey の補正を使用した一元配置分散分析によって実行されました。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。 miR-29a-3p: マイクロRNA-29a-3p; Robo1: ラウンドアバウトホモログ 1

miRNA の制御と機能は臓器および細胞の種類に非常に特異的であることが以前に示唆されています [41]。 HSC は肝臓における筋線維芽細胞の主な供給源です [5]。我々の発見は、ヒトおよびマウスの住血吸虫感染誘発性肝線維症におけるmiR-29a-3pの機能的役割の証拠を提供するものである。我々のデータは、肝線維症中に HSC で miR-29a-3p が下方制御され、Robo1 が上方制御されることを示しました。特に、我々の発見は、miR-29a-3pがRobo1を標的として住血吸虫症誘発性肝線維症を部分的に逆転させ、感染中に住血吸虫症誘発性HSC活性化を防ぐことを示唆している。

MiR-29 ファミリーのメンバーは fibromiR と考えられており、複数の臓器の線維化の過程で調節不全になることが示されています [42]。これらの分子は、複数のコラーゲンアイソフォームおよび他の ECM コンポーネントを制御します [43]。一般に、miR-29 ファミリーメンバーの発現低下は、さまざまな組織における ECM 沈着および線維症の増加に関連しています。 miR-29 種の役割は、動物モデルおよび肝線維症の患者の生検で広く研究されています [17、26、27]。しかし、住血吸虫症によって引き起こされる肝線維症における miR-29 の役割を調べた研究はこれまでにありません。本研究では、住血吸虫症誘発性肝線維症のある肝臓組織では miR-29a-3p が減少していることを発見しました。以前の研究では、miR-29a-3p の潜在的な標的として Robo1 が乳腺細胞における TGF-β1 標的遺伝子であることが特定され [44]、これは Robo1 が肝線維症の進行に関与している可能性があることを示した。一方、我々は対照患者と住血吸虫症患者におけるRobo1の発現を調べた。我々の結果は、肝線維症のある肝組織ではRobo1の発現レベルが有意に高いことを示しました。さらに、線維症患者の肝組織における miR-29a-3p および Robo1 の mRNA レベルは、肝線維症の程度に伴って増加する門脈直径および脾臓の厚さと関連していた [45、46]。さらに重要なことは、Robo1 産生細胞が主に HSC に存在することを示したことです。さらに、HSC における Robo1 発現が感染後に有意に増加することも発見しました。これらの結果は、miR-29a-3p と Robo1 が住血吸虫感染時の HSC を介した肝線維症の病因に関与していることを示唆しています。

in vivo での miR-29a-3p と Robo1 の役割をさらに確認するために、以前の研究からの情報に基づいて S. japonicum 感染のマウスモデルを確立しました [6、47]。未感染群と比較して、住血吸虫感染マウスでは肝組織におけるmiR-29a-3pの低下とRobo1の発現量の増加が示され、これらの発現レベルは肝線維症の進行段階と関連していた。さらに、miR-29a-3p の発現レベルは、肝細胞および KC と比較して、感染マウスの HSC で有意に下方制御されていました。一貫して、我々のデータはまた、住血吸虫感染中にRobo1産生が主にHSCと共局在することを示した。さらに、miR-29a-3p と Robo1 の間のターゲティング関係は、初代マウス HSC およびヒト HSC 細胞株 LX-2 を使用して確認されました。これらの結果は、HSCにおけるmiR-29a-3p-Robo1シグナル伝達の役割に関する機能データを裏付けており、このシグナル伝達が住血吸虫感染時のHSCを介した肝線維症の病因に関与していることを示唆しています。

HSC の異常な活性化は、肝線維症の発症における重大な事象として長い間確立されてきました [5]。これまでの研究では、ネズミやヒトの感染症における日本住血吸虫卵肉芽腫の周囲に活性化HSCが存在することが実証されており、これらの細胞は肉芽腫関連線維症に寄与するエフェクター細胞である可能性が高く、このことは、がんの進行における星細胞モジュレーターの重要性を強調している。肝住血吸虫症[6]。 miR-29a に抗線維化活性があることを示唆する証拠が増えています。黄ら。 MiR-29aを過剰発現するトランスジェニックマウスは、BDLまたは高脂肪食後のHSCの線維形成促進表現型を調節することによって肝線維症を改善したと報告した[48、49]。 1 つの有望な研究では、尾静脈を介した miR-29a 投与後の CCl4 誘発性肝線維症からの回復の促進が実証されました [50]。私たちの研究は、住血吸虫感染マウスにおける miR-29a-3p の過剰発現が肝細胞損傷と肝線維症を著しく妨げることを実証しました。さらに、miR-29a-3p の過剰発現は、活性化 HSC における Robo1 発現を有意に減少させ、住血吸虫症によって誘発される HSC 活性化を軽減しました。 TGF-β1 は最も強力な線維形成促進性サイトカインです [51]。以前の研究では、TGF-β1が住血吸虫症の発病に重要な役割を果たしていることが確認されている[52]。 miR-29a-3p と Robo1 の間の相互作用、およびこの相互作用が HSC 活性化に及ぼす影響を調査するために、miR-29a-3p アゴミルを LX-2 細胞にトランスフェクトし、続いて TGF-β1 に曝露しました。予想通り、miR-29a-3p の過剰発現により、TGF-β1 誘導性の Robo1 およびコラーゲンの発現が大幅に減少することがわかりました。これらのデータは、HSC における miR-29a-3p-Robo1 シグナル伝達が肝線維症の病因を媒介し、miR-29a-3p の過剰発現が Robo1 発現を低下させ、感染時の HSC 活性化を防ぐことにより、住血吸虫誘発性肝線維症に有益な効果を及ぼすことを総合的に実証しました。

上に示したように、我々の結果は、HSC における miR-29a-3p-Robo1 シグナル伝達経路が肝線維症の発症に重要な役割を果たしているという実験的および臨床的証拠の両方を提供し、miR-29a-3p 過剰発現が住血吸虫誘発性疾患を逆転させることができることを強く示唆しています。感染時のHSC活性化を抑制することにより肝線維化を抑制します。プラジカンテルは住血吸虫を効果的に標的にして殺すことができるが、肝線維症の進行は持続する[53]。現在までに承認された抗線維化療法はありません。我々のデータは、miR-29a-3pの過剰発現がHSC活性化を抑制することによってそのような肝線維症を軽減することを明確に示した。したがって、miR-29a-3p は、肝線維症を予防または治療するための治療ツール開発の有望な候補になります。しかし、さらなる研究が明らかに正当化されています。

我々の結果により、HSCにおけるmiR-29a-3p-Robo1シグナル伝達が肝線維症の病因を媒介し、miR-29a-3pの過剰発現がRobo1の発現を低下させ、Robo1の活性化を阻害することにより、住血吸虫誘発性肝線維症に有益な効果をもたらしたことが明らかになった。感染中のHSC。したがって、我々の研究は、住血吸虫症肝線維症の miR-29a-3p 調節機構についての洞察を提供し、線維性疾患の治療介入としての miR-29a-3p の可能性を強調しています。

この研究の結論を裏付けるすべてのデータが記事に含まれています。

アラニンアミノ基転移酵素

アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ

α-平滑筋アクチン

胆管結紮

四塩化炭素

細胞外マトリックス

ウシ胎児血清

肝細胞

肝星細胞

クッパー細胞

マイクロRNA

マイクロRNA-29a-3p

メッセンジャー RNA PBS リン酸緩衝生理食塩水

リン酸緩衝生理食塩水

ラウンドアバウトホモログ 1

日本住血吸虫

トランスフォーミング成長因子-β1

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寄生虫感染症に関してご協力いただいた華中科技大学同済医科大学基礎医学部寄生虫学科のスタッフに感謝いたします。

この研究は、国家科学技術主要プロジェクト（番号 2014ZX10005001、番号 2018ZX10302204-001）および湖北省保健委員会の科学研究プロジェクト（番号 WJ2021M20）の支援を受けました。資金提供者は、研究の設計、データの収集と分析、出版の決定、原稿の準備には何の役割もありませんでした。

中国武漢の華中科学技術大学同済医科大学同済病院感染症科および研究所

ホンヤン・コン、ダンダン・シャン、シュアイウェン・ファン、シン・シュー、ジーナン・ヘ、ランユエ・パン、ラン・タオ、ハイジン・ユー、ジャクアン・ファン

深セン癌研究所北京大学深セン胃腸癌トランスレーショナル研究重点研究所深セン北京大学・香港科技大学（PKU-HKUST）医療センター癌研究所深セン湾研究所（中国深セン）

ソング・チーチン

中国恩施市建市人民病院消化器科

胡文江

中国、武漢の華中科学技術大学同済医科大学同済病院小児科

郭秀仙

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HK、QS、および JH が研究を設計しました。 HK、QS、WH、SG、DX、SH、XX、JH、LP、RT、HY が実験データを取得しました。 HK と JH はデータ分析に貢献し、原稿を執筆しました。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

黄佳泉氏への通信。

このヒトでの研究は、華中科技大学同済医科大学同済病院の倫理委員会によって承認された（許可番号：20150103）。研究はヘルシンキ宣言に従って、すべての患者からの書面によるインフォームドコンセントを得て実施されました。すべての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに厳密に従って実施され、華中科技大学同済医科大学の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されました。 (IACUC no. 629)。

適用できない。

著者らは、競合する利益を持たないことを宣言します。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

MIR29A マウス構築の概略図。 Hipp11 (H11) 遺伝子座は、マウス 11 番染色体上の Eif4enif1 遺伝子と Drg1 遺伝子の間の遺伝子間領域内に位置します。ヒト MIR29A 遺伝子 (NCBI ReferenceSequence: NR_029503.1) は、ヒト 7 番染色体に位置します。コンディショナルノックインモデルの場合、「CAG-loxP-Stop-loxP-human MIR29A-polyA」カセットは、H11 遺伝子座 (Eif4enif1 遺伝子の 5' 〜 0.7 kb および Drg1 遺伝子の 3' 〜 4.5 kb) に挿入されました。 Cas9 と gRNA を、マウス生産用のターゲティングベクターとともに受精卵に同時注入しました。子犬は、PCR とそれに続く配列分析によって遺伝子型を特定されました。

単離された HSC の純度。 (A、B) フローサイトメトリーおよび免疫蛍光による HSC 精製の代表的な結果。挿入図は、輪郭が描かれた領域を高倍率で示しています。スケールバー、50μm。

MIR29A マウスは、さまざまな臓器でより高いレベルの miR-29a-3p を持っていました。 WT マウスと MIR29A マウスのさまざまな臓器における miR-29a-3p 発現レベルを qPCR によって測定しました。データは、3 つの独立した実験の平均 ± SD として表示されます。有意性は両側スチューデント t 検定によって決定されました。 ***P < 0.001、****P < 0.0001。 miR-29a-3p: マイクロRNA-29a-3p。

住血吸虫感染中の異なる群における寄生虫負荷の変化。感染したWTマウスおよびMIR29Aマウスにおける寄生虫負荷の変化。miR-29a-3pアゴミル投与後の寄生虫負担の変化。データは、3 つの独立した実験の平均 ± SD として表示されます。有意性は、両側スチューデント t 検定 (A) または 2 つのグループ間の比較のためのテューキー補正を伴う一元配置分散分析 (B) によって決定されました。 miR-29a-3p: マイクロRNA-29a-3p。

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転載と許可

Kong、H.、Song、Q.、Hu、W. 他マイクロRNA-29a-3pは、肝星細胞のラウンドアバウトホモログ1を標的とすることにより、日本住血吸虫誘発性肝線維症を予防します。寄生虫ベクター 16、184 (2023)。 https://doi.org/10.1186/s13071-023-05791-4

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受信日: 2023 年 1 月 26 日

受理日: 2023 年 4 月 27 日

公開日: 2023 年 6 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05791-4

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