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Dec 15, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9306 (2023) この記事を引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ここでは、グリーンケミストリーの原理を使用して得られたコーヒー廃棄物からの前駆体カーボンドット（cofCD）とGdドープナノハイブリッド（cofNH）の比較毒性評価を、in vivoでの血液学的、生化学的、組織病理学的アッセイを使用して実施しました（CD1マウス、腹腔内投与、14日間）。 、およびインビトロでの神経化学的アプローチ（ラット皮質神経終末、シナプトソーム）。 血清生化学データにより、cofCD および cofNHs 処理グループでも同様の変化が明らかになりました。つまり、肝臓酵素の活性とクレアチニンには変化はありませんでしたが、尿素と総タンパク質の値は減少しました。 血液学データは、両方のグループでリンパ球の増加とそれに伴う顆粒球の減少を示し、これは生体内の炎症過程を示す可能性があり、肝組織病理学によって確認されました。 赤血球関連パラメーターと血小板数が減少し、平均血小板体積が増加しました。これは血小板の成熟に関する懸念を示している可能性があり、脾臓の組織病理学によって確認されました。 したがって、cofCD と cofNH は腎臓、肝臓、脾臓に対して比較的安全であることが示されましたが、血小板の成熟と赤血球生成については懸念がありました。 急性神経毒性研究では、cofCD および cofNH (0.01 mg/ml) は、神経末端調製物中の L-[14C]グルタミン酸および [3H]GABA の細胞外レベルに影響を与えませんでした。 したがって、cofNH は血清生化学および血液学アッセイで最小限の変化を示し、急性神経毒性の兆候がなく、将来的には生体適合性の非毒性の治療薬と考えることができます。

治療実体内でのイメージングモダリティの組み合わせは、従来の治療の限界を克服するための有望なアプローチであり、最終的には治療効果を向上させます。 これに関連して、ハイブリッド ナノ材料であるナノハイブリッド (NH) は、その独特の物理的および化学的特性により、生物医学において特に関心を集めています1。 磁気共鳴画像法 (MRI) は、最も普及している生体画像診断技術の 1 つです。 ランタニドの中でも、MRI 診断に最適な造影剤 2 はガドリニウム (Gd) です。その高い磁気モーメントと最長の電子スピン緩和時間 3 により、最高のコントラストの MRI 画像が得られます。 ナノ構造への Gd の組み込みは、一方では生体内での毒性を軽減することができ、他方では腫瘍内でのナノ粒子の蓄積現象を利用することを可能にします。 毒性を克服するために、Gd は通常、ナノベシクル (リポソームやミセルなど)、金属ナノ粒子、カーボン ナノ材料などの内部に埋め込まれます 4、5、6、7、8、9。

カーボン ナノマテリアルの中でも、カーボン ドット (CD) は、低コスト、簡単な製造方法、環境への影響の少なさ、学際的な応用の可能性のため、特に興味深いナノマテリアルの多様性に富んだクラスを構成しています 10, 11。CD 製造の主な利点は、さまざまな前駆体と方法を使用することが期待されており 12、さらに CD はグリーンケミストリーの原理に従って取得できます。 それらの合成の方法論的アプローチには、マイクロ波支援熱分解、電気化学的水熱法、ソルボサーマル法などが含まれます。 また、グリーンケミストリーの原則によれば、バイオ廃棄物は CD の製造に広く使用されており、特に小麦わら 14、米残渣 15、フェヌグリーク種子 16、果物や野菜の皮 17、18、19、20、サトウキビ糖蜜 21、コーヒー廃棄物 22、23、24、 25,26 など。CD は芳香族部位と脂肪族部位が共存する欠陥のある組成を持ち、その基本構成要素はグラフェン、酸化グラフェン、ダイヤモンドであり、その割合とバリエーション、および表面の基の種類はオリジナルによって異なります。材料とその合成条件。

CD は、その前駆体と製造方法に応じて異なる生体毒性を示しました。 我々の以前の研究では、マイクロ波加熱によってβ-アラニンから得られたCDの神経活性特性が実証されました。 これらのナノ粒子（高濃度）は、単離されたラット脳神経終末における抑制性および興奮性、すなわちグルタミン酸およびγ-アミノ酪酸（GABA）作動性の神経伝達の重要な特性に影響を与えた27。 グルタミン酸とGABAはそれぞれ中枢神経系において重要な興奮性神経伝達物質と抑制性神経伝達物質であり、その輸送と恒常性の障害が神経機能不全と主要な神経疾患の発症に寄与することを強調する必要がある。 他の研究では、チオ尿素から合成された硫黄含有 CD は、硫黄を含まない CD と比較して、神経終末におけるグルタミン酸および GABA 輸送に対する効果が 3 分の 1 低いことが明らかになりました 28。

文献データは、市販の合成化学物質から合成された CD に、エネルギー的に不利な水熱処理 29,30,31,32 と採用されたマイクロ波支援法 33 を使用して Gd をドープできることを示しました。 Gd をドープした炭素ベースのナノ粒子の毒性に関するデータは不足しています。 特に、Gd-DTPA と L-アルギニンを使用したワンステップ無溶媒技術で合成された Gd ドープ CD (Gd-CD) の潜在的な毒性を血清生化学分析によって評価しました。 Gd-CD は、長期適用において動物に対する毒性が低いことが実証されました 34。 他の研究では、3,4-ジヒドロキシヒドロ桂皮酸、2,2'-(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)および塩化ガドリニウムを用いた水熱法を使用して、Gd-CDが調製されました。 Gd-CD の溶血アッセイでは、顕著な溶血現象は見られず、赤血球への損傷が少なく、血液との生体適合性があることが示されました。 ヒト胎児腎臓細胞 (293 T 細胞、CCK-8 アッセイ) を使用した細胞毒性研究では、細胞生存率は Gd-CD によって変化せず、in vitro での細胞毒性が低いことが示されました。 処置されたマウス組織の組織病理学データは、対照群と比較して、心臓、腎臓、肝臓、脾臓に明らかな異常や病変を示さなかった。 Gd-CD は良好な生体適合性を示し、さらなる生体応用に適していると結論づけられました 31。 また、Gd メグルミンをクエン酸およびジエチレントリアミンとともに使用して、一段階水熱法により Gd-CD を合成したところ、ナノ粒子は目立たない細胞毒性を示しました 32。 AS1411 アプタマーと結合した Gd-CD は、簡単なソルボサーマル アプローチによって調製されました。 in vitro アッセイでは対照群と比較して 4T1 細胞に明らかな損傷はなく、in vivo でのナノ粒子適用後に明らかな溶血は観察されず、合成されたナノ粒子は良好な生体適合性を示しました 35。

Gd 自体が生体毒性の特徴を持っているため 36、37、38、Gd のドーピングがナノ粒子の毒性に寄与しているかどうかという疑問が生じました。 Gd-CD とその前駆体である官能基化されていない Gd-CD との比較毒性に関する文献データはありません。

上記の事実を考慮して、この研究の目的は以下のとおりでした: (*) グリーンケミストリーに基づいて得られたコーヒー廃棄物 (cofNHs) から得られる新しい観点からの超小型の炭素ベースの Gd ドープナノハイブリッドの多段階毒性評価、および (*) *) cofNH の毒性と、その前駆体であるコーヒー廃棄物由来の非官能化 Gd フリー CD (cofCD) との比較。 ナノ粒子の in vivo 投与後の血液学的、生化学的および組織病理学的方法論的アプローチと、in vitro での急性神経毒性研究を使用します。 後者は、ラットの皮質（シナプトソーム）から単離された神経終末を使用して、グルタミン酸およびGABA作動性の神経伝達の重要な特性に対するcofCDとcofNHの比較効果を特徴付けました。これは、シナプス前プロセスを探索するための最良のモデルシステムの1つです39。

実験動物のどのグループでも毒性は観察されませんでした。 対照群およびｃｏｆＣＤ群では死亡率も観察されなかったが、ｃｏｆＮＨ群では研究６日目に１匹のマウスが死亡した。 さらに、死亡した動物を除くすべての動物は、グループ間に統計的に有意な差がなく、連続的な体重増加を示した。これは、記載された用量で14日間適用した場合、マウスの健康状態と試験されたナノ粒子の毒性がないことを示唆している可能性がある（図1）。

対照マウスおよびcofCDおよびcofNHで14日間処置したマウスの体重動態(絶対体重変化(a)および相対体重変化(b))。

図 2 に示すデータによると、cofCD と cofNHs の両方の適用により、リンパ球 (LYM) の割合が増加する傾向があり (それぞれ p = 0.129 および p = 0.071)、同時に好中球顆粒球 (GRAN) の割合が減少しました (p =それぞれ0.179およびp = 0.063）。 これらの変化は通常、ウイルスや慢性細菌感染、自己免疫疾患など、生体内の何らかの特定の炎症過程の証拠です40。 しかし、白血球の絶対数に変化がない場合は、真の炎症ではなく、むしろ免疫反応の変化が考えられます。 自己免疫疾患の場合、リンパ球刺激の結果として LYM% の増加が起こる可能性があります。 実際、CD はそのような影響を引き起こす可能性があります41。 したがって、観察された変化は、試験したナノ粒子に対する免疫応答の何らかの変化を示す可能性があることを示唆します。 ただし、観察された値は依然として CD-1 マウスに典型的な正常範囲内にあることに注意してください42。

対照マウス、および研究の最終日に14日間cofCDおよびcofNHで治療されたマウスの血液学的パラメーター。 *p < 0.05、**p < 0.01。

赤血球（RBC）数と関連パラメーター（ヘモグロビン（HGB）、ヘマトクリット（HCT）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（MCHC）値）は、同様の方法でcofCDとcofNPの両方の値の減少を示しました。 RBC、HGB、HCT、および MCHC の減少は赤血球生成の阻害を示す可能性があり、Gd はおそらくこのプロセスに寄与していません。 したがって、両方のグループにおける平均血小板体積（MPV）の増加とそれに伴う血小板数（PLT）数の減少は、血小板成熟プロセスの変化を示す可能性があり、やはり、Gdがその主な原因であるとは考えられていません。 総合すると、炎症と赤血球生成および血小板形成の違反の証拠がいくつかあり、炭素コアがこれらのプロセスに主に寄与しているように見え、Gd はそれに追加の毒性を加えていないようです。

図 3 に示したデータによれば、肝臓酵素の活性に有意な変化はなく、これは cofCD と cofNP の両方が肝機能に実質的な影響を及ぼさないことを証明している可能性があります 43。 cofCDs および cofNH 処理グループにおける尿素の減少は、総タンパク質の減少傾向とともに (それぞれ p = 0.147 および p = 0.129) です。 このようなデータは、タンパク質の摂取量不足や吸収不良、あるいは肝臓で起こるタンパク質の合成や代謝に関する問題による生体内のタンパク質欠乏を示す可能性があります44。 すべてのグループのマウスは研究期間中継続的に体重が増加したため（図 1）、したがって、栄養失調は除外できます。 したがって、血清中の尿素が減少する理由は、タンパク質代謝障害の結果である可能性があります。 ただし、対照と比較して顕著な変化にもかかわらず、血清尿素の値は CD-1 マウスに典型的な正常範囲内にあることに注意する必要があります 42。

対照マウス、および研究の最終日に14日間cofCDおよびcofNHで処置したマウスの血清生化学パラメータ。 **対照と比較して p < 0.01。

血清クレアチニン濃度の変化がなければ、腎機能への影響がないことが証明される可能性があります。 cofCD と cofNP の両方を総合すると、タンパク質合成の阻害につながる可能性がありますが、適用用量のこれらのナノ粒子は肝臓および腎臓の機能に実質的な違反を引き起こしませんでした。

表１、２、３および図４に示される組織病理学的データによれば、ｃｏｆＣＤおよびｃｏｆＮＨは両方とも、損傷と考えられるような肝臓、腎臓および脾臓の状態に実質的な影響を与えなかった。 ただし、まだ構造的な変化がいくつかありました。 したがって、cofCD と cofNH は両方とも、組織全体にわたるわずかなクッパー細胞の蓄積と時折の白血球の蓄積遺伝子座によって示される、肝臓における軽度の炎症兆候を誘発しました。これは、我々の血液学的所見と一致しています。 cofNH 治療群では、血管のうっ血も時々発生しました。

対照マウスとcofCDおよびcofNHで処理したマウスの腎臓、肝臓、脾臓の顕微鏡写真。 倍率×100、H&E。 スケール 100 μm。

腎臓では、cofCD および cofNH 治療群の両方で刷子縁のわずかな尿細管上皮の喪失が観察されましたが、血清クレアチニンおよび尿素レベルによって証明されるように、腎機能には影響を与えませんでした。 また、これら 2 つのグループでは軽度の尿細管過形成が発生しましたが、これは慢性進行性腎症中に発生したにもかかわらず、尿細管細胞の増殖と尿細管再生の兆候であると考えられています 45。 したがって、腎臓は試験された化合物によって影響を受けているものの、正常に再生していると結論付けることができます。 次に、cofNH 治療群では血管拡張が時々起こるが、これは肝臓での所見と同様であり、これらの臓器の血液供給に何らかの変化があったことを示す可能性がある。

脾臓の組織病理学的変化は、cofCD 処置マウスと cofNP 処置マウスの両方で同様でした。 辺縁帯過形成（軽度）および巨核球数の増加としての巨核球症（軽度から中等度）が観察され、さらに時折壊死部位も観察されました。 辺縁帯の過形成は、主にマクロファージが生息しているため、食細胞系が何らかの活性化していることを示す可能性があります45。 脾臓におけるナノ粒子の蓄積の可能性に関する我々のデータは文献 46, 47 と一致している。巨核球症は血小板の成熟と分化の違反の場合に一般的であり 48、これは血液学的所見に基づく我々の示唆を裏付けるものである。

したがって、腎臓、肝臓、脾臓に対する cofCD と cofNH の両方の相対的な安全性が示唆される可能性があります。 しかし、血小板の成熟と赤血球生成、および主に炭素コアによって引き起こされる肝臓の軽度の炎症過程についてはいくつかの懸念がありました。 それにもかかわらず、これらの変更は最小限であったため、複数の cofCD または cofNHs アプリケーションにとって障害にはならない可能性があります。 次に、cofCD 処理群と cofNH 処理群で生化学的、血液学的、組織病理学的値に差がないことから、cofCD コアによる Gd の強力な捕捉が結論付けられる可能性があります。

膜電位は、電位感受性蛍光色素ローダミン 6G を使用してモニタリングされました。 定常状態レベルでの膜電位指数である Fst は 5 分間で達成され、統計計算ではそれを 100% として設定しました。 図5a、bに示す蛍光実験では、cofCDとcofNHの両方が神経終末の膜電位を変化させず、したがって細胞膜を脱分極させないことが明らかになりました。 比較するために、KCl (35 mM) によって誘発される神経終末の膜脱分極の時間経過を図 5 に示しました。

蛍光実験: cofCD および cofNH の存在下での神経終末の膜電位。 (a) シナプトソームの懸濁液を電位感受性色素ローダミン 6G (0.5 mM) で平衡化しました。 色素蛍光が安定したレベルに達したら、SSS (コントロール)、cofCD (0.01 mg/ml)、cofNH (0.01 mg/ml)、および KCl (35 mM) (矢印でマーク) をシナプトソームに添加しました。 。 トレースは典型的なもので、異なるシナプトソーム調製物を使用して実行された 12 回の実験を表しています。 (b) cofCD (0.01 mg/ml)、cofNH (0.01 mg/ml)、および KCl (35 mM) の適用に応答したローダミン 6G の蛍光シグナルの増加。 データは平均値±SEMです。 ***、対照と比較して p < 0.001。 ns、大きな違いはありません。 n = 12。

Na+依存性グルタミン酸およびGABAトランスポーターは、シナプス前神経終末の細胞質への神経伝達物質の取り込みと神経伝達物質の適切な細胞外レベルの確立を媒介するシナプス神経伝達における戦略的プレーヤーです。 後者は、神経伝達物質のトランスポーター媒介取り込み値と非刺激漏出値の間の動的エネルギー依存バランスを表す重要なシナプスパラメーターです49、50。

表４に示すように、神経末端調製物中のＬ－［１４Ｃ］グルタミン酸の細胞外レベルは、０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度のｃｏｆＣＤおよびｃｏｆＮＨによって変化しなかった。

表５に示すように、神経末端調製物中の［３Ｈ］ＧＡＢＡの細胞外レベルは、０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度のｃｏｆＣＤおよびｃｏｆＮＨによって有意に変化しなかった。 これらの結果は、上記の L-[14C]グルタミン酸データと一致しています。 ただし、cofNH はこの濃度で [3H]GABA のシナプトソーム細胞外レベルを増加させる強い傾向があることに注意する必要があります。

次の一連の実験では、神経終末標本中の L-[14C]グルタミン酸および [3H]GABA の細胞外レベルに対する Gd3+ の効果を評価しました。 cofNH の含有量に関連する 1 および 10 μM の Gd3+ 濃度の Gd3+ は、神経終末標本中の L-[14C]グルタミン酸および [3H]GABA の細胞外レベルを有意に変化させないことが判明しました (表 6)。 ただし、10 μM の濃度の Gd3+ は、L-[14C]グルタミン酸と [3H]GABA の両方のシナプトソーム細胞外レベルを増加させる強い傾向があることに注意する必要があります。

ここでは、cofCD と cofNH の一般毒性と急性神経毒性の比較評価が、それぞれ in vivo 実験と in vitro 実験で行われました。 血清生化学の結果では、主要な肝酵素に変化がないことが明らかになり、この臓器に対する実質的な毒性がないことを証明できましたが、いくつかの炎症性の兆候が観察されました。 両方のグループの尿素の減少と TP の減少傾向は、タンパク質合成の阻害を示す可能性があります。 総合すると、適用用量の両方の化合物は、肝臓および腎臓の機能に実質的な違反を引き起こしませんでした。 血液学データは、両方のグループで LYM% の増加とそれに伴う GRAN% の減少を示し、これは生体内の何らかの炎症過程を証明する可能性があり、肝臓における組織病理学的所見を裏付けました。 cofCD-およびcofNH-グループにおけるRBC、HGB、HCT、およびMCHCの（顕著なまたは傾向としての）減少は、赤血球生成の阻害を示す可能性があり、Gdはそれにほとんど寄与していませんでした。 MPVの増加とそれに伴うPLTの減少は、血小板成熟プロセスの変化を証明する可能性があり、これは脾臓の組織病理学的所見と一致しています。 総合すると、炎症、赤血球生成および血小板形成の違反の証拠がいくつかありました。 cofNH治療群ではcofCD治療群と比較して生化学的、血液学的、組織病理学的値の差がほとんど観察されなかったため、cofCDコアがこれらのプロセスに大きく寄与している可能性が高いと結論付けることができました。

cofNH の一般的な毒性に関する我々の実験データは文献データと一致しています。 特に、Gd-CD と Gd-DTPA (広く使用されている造影剤) の潜在的な毒性を、Gd-CD (Gd 濃度 5 mg/kg) と Gd-DTPA を尾静脈から注射したマウスで比較しました。 血清生化学分析では、血液サンプルが 1 ～ 21 日間収集されました。 Gd-CDはGd-DTPAと比較して同様の効果を示すことが判明した。 腎臓指標、血中尿素窒素およびクレアチニンの分析では、対照群とGd-CDs群の間の差異は明らかにならず、それによって腎機能への損傷がないことが実証されました。 肝機能分析では、1 日間の注射後に AST および ALT 値がわずかに増加しました。 肝臓の指標であるアルブミンと総タンパク質は正常レベルに維持されました。 Gd-CD および Gd-DTPA は、肝組織に重大な損傷を与えることなく、注射後すぐに肝機能に影響を与える可能性があります。これは、肝臓が 7 日間の注射後に速やかに機能を回復するためです。 総合すると、これらの結果は、動物に対する Gd-CD および Gd-DTPA の毒性が低いことを実証しました 34。 他の研究では、Gd-CD（3,4-ジヒドロキシヒドロ桂皮酸、2,2'-(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)および塩化Gdを使用した水熱法を使用して調製されたもの)の投与後に溶血は明らかにされず、それにより赤色への損傷がほとんどないことが示されました。血球と血液との生体適合性。 in vivo での毒性研究における Gd-CD 注射後 24 時間後の臓器の組織学的分析では、Gd-CD 投与群に炎症反応、肺線維症、壊死や主要臓器の損傷などの明らかな損傷は認められませんでした。 健康な昆明マウスモデルに対する 16 日間の in vivo 長期毒性は、TP、ALT、AST、ALP、血中尿素窒素、総​​コレステロール、およびトリグリセリドの評価に基づいて、Gd-CD がマウスに明らかな肝臓障害または腎臓障害を誘発しないことを明らかにしました。 。 Ｇｄ－ＣＤｓで処置したマウスの組織病理学では、対照と比較して、心臓、腎臓、肝臓、脾臓に明らかな組織病理学的異常や病変は観察されなかった。 組織学的サンプルでは壊死の兆候は示されませんでした。 肺組織では、中程度の肺炎症反応を示す気管支周囲および血管周囲の細胞浸潤が示された。 Gd-CD は生体内で良好な生体適合性を示し、さらなる生体応用に適している可能性があると結論付けられました 31。 AS1411 アプタマーと結合した Gd-CD (AS1411-Gd-CD) の血液適合性を研究したところ、溶血現象は観察されませんでした。 AS1411-Gd-CD は、生物学的分野での応用に関して優れた生体適合性を備えていると結論付けられています 35。

in vitro での急性神経毒性研究では、cofCD は、濃度 0.01 mg/ml の神経末端調製物中の L-[14C]グルタミン酸および [3H]GABA の周囲レベルに影響を与えませんでした。 CofNH は L-[14C]グルタミン酸の細胞外レベルに影響を与えませんでしたが、この濃度では [3H]GABA の細胞外レベルを増加させる傾向があります。 Gd の寄与の評価により、関連濃度の Gd3+ イオンは有意な変化を示さなかったが、神経終末調製物中の両方の神経伝達物質の細胞外レベルを増加させる傾向があることが明らかになりました。 cofNH はこの濃度では Gd 神経毒性を軽減できなかったにもかかわらず (両方とも無毒)、cofNH 構造に組み込まれた Gd の存在により、腫瘍蓄積ナノ粒子現象に基づいた生物医学的応用において腫瘍内に Gd が蓄積することが可能になります。 CofCD の神経毒性の結果は、β-アラニンから得られた関連濃度の CD、およびチオ尿素とクエン酸からの硫黄含有 CD に関する以前の実験と一致しています 27, 28。特に、0.01 mg/ml の濃度の β-アラニンからの CD は、神経毒性に影響を与えませんでした。神経終末標本中の L-[14C]グルタミン酸および [3H]GABA の細胞外レベル 27。 チオ尿素およびクエン酸からの硫黄含有 CD も、両方の神経伝達物質のシナプトソーム細胞外レベルに影響を与えませんでした 28。

CofNH に関する in vitro での急性神経毒性データは文献データと一致しています。 ヒト胎児腎臓細胞 (293 T 細胞) と CCK-8 アッセイを使用した in vitro 細胞毒性研究では、Gd-CD (3,4-ジヒドロキシヒドロ桂皮酸、2,2'-(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン) を使用した水熱法を使用して調製および塩化Gd）は、1 mg/mLの高濃度であっても、24時間のインキュベーション後でも細胞生存率に変化はなく、これはインビトロでの細胞毒性が低いことを示しています31。 他の研究では、一段階の水熱法によって得られた Gd-CD は、目立たない細胞毒性を有することが示されました 32。 特に、NIH3T3 および 4T1 細胞と CCK-8 アッセイを使用すると、細胞は 24 時間の同時インキュベーション後も高い生存率を維持することが示され、それによって AS1411 アプタマーと結合した Gd-CD が誘導する毒性は無視できるほどであることが示されました 35。

将来的には、方法論的アプローチを最適化し、有意に高い（50倍）cofCDおよびcofNH濃度で急性神経毒性研究を実施し、cofNHによる神経終末標本中の細胞外[3H]GABAレベルが増加する傾向があるかどうかを確認する予定です（表 4) では、このパラメータが大幅に増加しました。 これは、これらのナノ粒子の不透明性と茶色のため、比較的低濃度の cofCD および cofNH が in vitro 実験に適用されたためです (以前の CD 関連研究 27、28 と比較して)。 神経終末に適用された Gd3+ イオンのナノ粒子関連濃度 (表 5) も高くありませんでした。 それにもかかわらず、ナノ粒子のこれらの濃度は、生体内動物研究で使用されるcofCDおよびcofNH濃度と相関関係があり、動物の潜在的なMRIイメージングに適用できます。 神経終末標本中の細胞外 [3H]GABA レベルを増加させる cofNH の潜在的な能力は、追加の神経化学療法の特徴として使用できます。 理論的には、周囲のグルタミン酸レベルには影響を及ぼさないが、神経終末における周囲のGABAレベルを増加させる化合物は、抗てんかん、鎮静、催眠効果を有する可能性があります。

EGTA、EDTA、HEPES、Ficoll 400、Sigma-Fluor® High Performance LSC Cocktail、分析グレードの塩は Sigma (米国) から購入しました。 L-[14C]グルタメートおよび[3H]GABA (γ-[2,3-3H(N)]-アミノ酪酸)は、Perkin Elmer (米国マサチューセッツ州ウォルサム) から入手しました。 ローダミン 6G は、Molecular Probes (米国) から入手しました。

マイクロ波を利用したコーヒー廃棄物からの cofCD および cofNH の「グリーン」合成は、追加の精製段階を備えた研究 51 に記載されているものと同様の技術に従って実行されました。 特に、5 g のコーヒーグラウトを 0.1 M GdCl3 溶液に浸漬し、乾燥させ、10% NH4OH 溶液に浸漬し、空気中で 250 ml 丸底フラスコ内の電子レンジで 10 分間焼結することで、アンモ酸化を同時に進めることが可能になりました。メイラード反応、アルドール縮合、フェノールのアルキル化、炭水化物の脱水などによる加水分解フラグメント間の反応と相互作用。ガドリニウム原子は、コーヒーに豊富に含まれるヒドロキシ桂皮酸誘導体のヒドロキシル基だけでなくカルボキシル基にも保持される可能性があります52。 53. 次に、ナノ粒子を蒸留水に再懸濁し、異なる孔径のポリエーテルスルホン (PES) 膜を備えた Vivaspin 20® 濃縮装置で濾過して、分子量 30 kDa 未満の画分を取得し、3,500 MWCO (ZelluTrans ROTH® 再生セルロース) の膜を通して透析しました。管状膜）を使用し、3,000 MWCO の Vivaspin 20® を使用して予備濃縮して、3 ～ 30 kDa の範囲のナノ粒子を取得します。 それらの物理的および化学的特性は部分的に特徴付けられており54、TEM画像（図S1を参照）およびFTIRスペクトル（図S2）が補足情報に提供されています。

この研究には、生後 10 ～ 11 週、初期体重 19.6 ± 3.0 g の雌 CD1 マウスを使用しました。 動物は、キエフのタラス・シェフチェンコ国立大学の動物施設で、20～23℃の自然光下で飼育され、標準化されたげっ歯類の餌と水道水は自由に摂取できるようになった。 すべての実験は、生命倫理の原則、立法基準、および実験およびその他の科学的目的に使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約55、第 1 回全国生命倫理会議 (キエフ、 2001)、施設内動物管理使用委員会によって承認されました (議定書 #1、2021 年 6 月 24 日)。

動物（ウィスターラット、雄、生後 12 週、体重約 120 g）は、ウクライナ国立科学アカデミーのパラディン生化学研究所の動物施設で飼育され、水と標準化されたげっ歯類の餌を自由に与えられ、飼育されました。 22～23℃に温度管理された部屋で。 動物実験は、欧州共同体のガイドライン (2010/63/EU) および現地の法律/政策に従って実施され、パラディン生化学研究所の動物管理使用委員会によって承認されました (9 月 21 日からのプロトコル #1)。 2020年）。 すべての動物研究は、動物を含む実験を報告するための ARRIVE ガイドラインに従って報告されました56、57。研究に使用されたラットの総数は 12 匹で、具体的には L-[14C]グルタミン酸と [3H] の細胞外レベルの測定でした。神経終末のGABA - 12匹の動物。 蛍光分析実験ではこれら 12 匹の動物を共有しました。

マウスをランダムに 3 つの治療グループ (各 n = 5) に割り当て、濃度 25.0 mg/ml のリン酸緩衝食塩水 (PBS) に溶解した cofCD および cofNH、または純粋な PBS (対照グループ) を 5 ml/ml の量で腹腔内投与しました。前臨床薬開発のための反復投与毒性研究の推奨に従って、連続 14 日間、毎日 kg (それぞれ 125 mg/kg の cofCD および cofNHs 用量に相当) を投与しました 58, 59。 研究の 15 日目に、マウスを次の方法で麻酔しました。 2,2,2-トリブロモエタノール (250 mg/kg) を投与され、頚椎脱臼により死亡した。

マウスの全身状態および体重を毎日監視した。 皮膚や被毛、目、粘膜、呼吸器系、姿勢、自発活動の変化などの外部状態を評価しました。 詳細なスコアリングシステムを表 7 に示します。観察は最初の投与直後、および観察期間中は 1 日 1 回実行されました。

心臓穿刺による屠殺直後に血液学的分析用の血液を採取し、25μlの新鮮な血液を等量の0.4% K2EDTA生理食塩水溶液を含むチューブに移した。 血液学的パラメータの評価は、採血後 2 時間以内に血液分析装置 MCL-3124 (Guangzhou Mecan Trading Co., Ltd.、中国) および消耗品試薬 Cormay (ポーランド) を使用して実施されました。 白血球数（WBC）、リンパ球（LYM）、中型細胞（単球、好酸球、好塩基球、MID）、好中球（GRAN）の絶対値および相対値、赤血球数（RBC）、ヘモグロビン（HGB）、ヘマトクリット（ HCT）、血小板数（PLT）、および平均体積（MPV）を測定しました。

生化学分析用の血液は、心臓穿刺による屠殺直後に採取し、60分間放置してフィブリン凝固を形成させた後、4℃、5400gで20分間遠心分離した。 血清を収集し、アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST)、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ (GGT)、乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH)、アルカリホスファターゼ (ALP)、尿素、クレアチニン、および総タンパク質（TP）。 分析は、全自動化学分析装置 MF-240 (MedFuture LLC、米国) を使用し、標準試薬キット (ポーランド、コーメイ) を使用し、製造元が提供するプロトコールに従って実施しました。

肝臓、腎臓、脾臓のサンプルを屠殺直後に採取し、10% 中性緩衝ホルマリンで 7 日間固定しました。 ホルマリン固定後、サンプルをエタノール溶液で脱水し、パラフィンに包埋し、厚さ 5 μm のスライドを得るために切断し、標準的な方法 60 に従って脱パラフィンし、ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で染色し、光学顕微鏡で検査しました。治療グループを知らなかった病理学者。 病理学的特徴は半定量的な方法で評価され、詳細なスコアリング システムが表 8 に示されています。

断頭したラットから単離した大脳皮質領域を直ちに取り出し、0.32 M スクロース、5 mM HEPES-NaOH、pH 7.4、および 0.2 mM EDTA を含む氷冷生理食塩水中でホモジナイズしました。 1 匹のラットから 1 つのシナプトソーム標本を取得し、各測定を 3 回繰り返しました。 シナプトソーム調製物は、61、62、63に従ってラット脳ホモジネートの分画遠心分離およびFicoll-400密度勾配遠心分離を使用して得られた。 シナプトソーム調製物は 2 ～ 4 時間の実験で使用されました。 標準食塩水 (SSS) には次のものが含まれていました (mM): NaCl 126; KCl5; MgCl2 2.0; NaH2PO4 1.0; HEPES 20、pH 7.4; D-グルコース 10. タンパク質濃度は 64 に従って検査されました。

シナプトソーム調製物を SSS でタンパク質 2 mg/ml の濃度に達するまで希釈し、37 °C で 10 分間プレインキュベートした後、L-[14C]グルタミン酸 (2.81 μM、1 μCi/ml) をロードしました。 37 °C の SSS で 10 分間。 ローディング手順の後、シナプトソーム懸濁液を 10 倍量の氷冷 SSS で洗浄しました。 ペレットをSSSに再懸濁して、タンパク質1mg/mlの最終濃度に達した。 シナプトソーム懸濁液 (125 μl; タンパク質 0.5 mg/ml) を 37 °C で 10 分間プレインキュベートし、次に cofCD および cofNH のアリコートを加え、シナプトソームとともに 10 分間インキュベートし、微量遠心分離機 (20 10,000gで）。 L-[14C]グルタミン酸の細胞外レベルは、Sigma-Fluor® High Performance LSC Cocktail (1.5 ml) および液体シンチレーションカウンター Hidex 600SL (フィンランド) を使用した液体シンチレーションカウンティングを使用して、上清のアリコート (100 μl) およびペレットで記録されました。 L-[14C]グルタミン酸のデータは、異なるシナプトソーム調製物を用いて行われたいくつか（n）の独立した実験から三重に収集されました。

シナプトソーム調製物を SSS でタンパク質 2 mg/ml まで希釈し、37 °C で 10 分間プレインキュベートした後、SSS に [3H] GABA (50 nM、4.7 μCi/ml) をロードしました。 10分。 GABA トランスアミナーゼ阻害剤であるアミノオキシ酢酸を 100 μM の濃度で [3H] GABA の負荷および放出実験中に使用して、GABA 代謝産物の形成を最小限に抑えました。 ローディング後、シナプトソーム懸濁液を 10 倍量の氷冷 SSS で洗浄しました。 ペレットをＳＳＳに再懸濁して、タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。 シナプトソーム懸濁液 (120 μl) を 37 °C で 10 分間プレインキュベートし、その後 cofCD および cofNH のアリコートを加えて 10 分間インキュベートし、微量遠心分離機 (10,000 g で 20 秒) を使用して沈降させました。 シナプトソーム調製物中の [3H]GABA の細胞外レベルを記録しました。 [3H]GABA 放射能は、Sigma-Fluor® ハイ パフォーマンス LSC カクテル (1.5 ml) および液体シンチレーション カウンター Hidex 600SL (フィンランド) を使用した液体シンチレーション カウンティングによって、上清のアリコート (90 μl) で測定され、値は次のように表されました。総蓄積シナプトソーム [3H]GABA67 の割合。 [3H]GABA データは、異なるシナプトソーム調製物を使用して実行されたいくつか (n) の独立した実験から 3 回収集されました。

cofCD および cofNH の存在下でのシナプトソームの膜電位は、膜への電位依存性結合に基づいて電位差測定蛍光色素ローダミン 6G (0.5 μM) を使用して測定されました 68、69、70。 シナプトソーム懸濁液 (タンパク質の最終濃度 0.2 mg/ml) を 37 °C で 10 分間プレインキュベートし、その後、継続的に撹拌しながらサーモスタット付きキュベットに加えました。 シナプトソーム懸濁液をプローブで平衡化し、cofCD および cofNH のアリコートを加えました。 原形質膜電位の変化を推定するために、膜電位の指標としての比 (F) を式: F = Ft/F0 に従って計算しました。ここで、F0 と Ft は、蛍光色素の非存在下および存在下における蛍光色素の蛍光強度です。それぞれシナプトソーム。 F0 は、指数関数的減衰関数を t = 0 に外挿することによって計算されました。ローダミン 6G による蛍光測定は、Hitachi MPF-4 分光蛍光光度計を使用して、528 nm (励起) および 551 nm (発光) の波長 (それぞれ 5 nm のスリットバンド) で実行されました。

GraphPad Prism 9.0.0 ソフトウェアを統計分析とデータの視覚化に使用しました。 分散の均一性は、Levene 検定を使用して評価されました。 実験データは、n 回の独立した実験の平均値 ± SEM として表されました。 2 つのグループ間の差異は、Tukey 事後検定を使用した一元配置分散分析 (ANOVA) によって比較されました。 独立したサンプルに対するマン・ホイットニー U 検定を、組織病理学的徴候スコアの分析に使用しました。 p < 0.05の場合、差異は有意であるとみなされました。

短期毒性試験（14 日間の投与）が実施されましたが、試験した化学物質に遅延毒性がないことについて厳密な結論を出すことはできません。 しかし、Gd ドープナノ材料の主な目的はバイオイメージングへの応用、つまり単回投与であるため、この毒性研究で使用される用語は少なくともナノ粒子の急性毒性を除外することを可能にしており、したがってこれらの前臨床動物研究を実施するための基礎となる可能性があります。長期投与中の化学物質。

要約すると、比較多レベル毒性評価により、腎臓、肝臓、脾臓に対する cofCD と cofNH の両方の相対的な安全性が示されました。 血小板の成熟と赤血球生成、さらには肝臓への影響の可能性についていくつかの懸念がありましたが、Gd の取り込みがそれに関連している可能性は低いと考えられます。 全体として、cofNH は、血清生化学および血液学アッセイにおいて、cofNH の生物医学的応用の障害にならない最小限の変化を示しています。 また、cofCD および cofNH は、神経終末標本中の L-[14C]グルタミン酸および [3H]GABA の細胞外レベルに影響を与えず、したがって急性神経毒性の兆候はありませんでした。 総合すると、cofNH は、治療薬としての観点から生物医学研究においてさらに分析できると考えられます。

現在の研究で使用されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。 ナノ粒子合成に関するデータの一部は、C'Nano 2023: The Nanoscience Meeting の議事録で入手できます。 ポワティエ、2023年。 p. 24.

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この研究は、Marie Skłodowska-Curie Action (プロジェクト 101008159 "UNAT") に基づく EU Horizo​​n 2020 Research and Innovation Staff Exchange Program (RISE)、およびウクライナ国立研究財団の助成金、Project #2021.01/0061 (AP、MD) によって資金提供されました。 、TB - 有機化合物の加熱によって得られるカーボンナノ粒子の神経毒性の評価）。

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ハリナ・クズニエツワ、ナタリア・ジウベンコ、コンスタンチン・パリエンコ、テティアナ・リセンコ、ヴァレリー・スクリシェフスキー、タチアナ・ボリソワ

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ハリナ・クズニエツワ、ナタリア・ジウベンコ、ヴァレリー・スクリシェフスキー

パラディン生化学研究所、ウクライナ国立科学アカデミー、9 Leontovicha Street、キエフ、01054、ウクライナ

コンスタンチン・パリエンコ、ナタリア・ポズドニャコワ、ナタリア・クリサノワ、アルチョム・パストゥホフ、テティアナ・リセンコ、マリーナ・ドゥダレンコ、タチアナ・ボリソワ

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ウラジミール・ルイセンコ

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概念化、TB、VL、VS、HK、ND。 方法論、KP、VL、HK、ND、NP、NK、AP、TL、MD、TB。 正式な分析、TB、HK、ND、NP、NK。 調査、KP、HK、ND、NP、NK、AP、MD; データキュレーション、KP、VL、TB、HK、ND、NP、NK。 執筆 - 元の草案の準備、TB。 監修、VS、VL、TB。 執筆 - 査読および編集、TB、HK、ND、NP、KP、VS。 資金調達、VS、VL すべての著者が原稿の出版版を読み、同意しました。

コンスタンティン・パリエンコ氏への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Kuznietsova、H.、Dziubenko、N.、Paliienko、K. 他コーヒー廃棄物からの炭素ベースの Gd フリー ドットと Gd ドープ ナノハイブリッドの比較マルチレベル毒性評価: 血液学、生化学、組織病理学および神経生物学の研究。 Sci Rep 13、9306 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36496-4

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受信日: 2023 年 4 月 3 日

受理日: 2023 年 6 月 5 日

公開日: 2023 年 6 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36496-4

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