従来のnDart1の統合により開発されたイネの分子的および生化学的特性評価

May 16, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8139 (2023) この記事を引用

332 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

突然変異、つまりゲノム配列の遺伝的変異は、分子生物学とバイオテクノロジーにおいて重要な役割を果たします。 DNA 複製または減数分裂中の突然変異の 1 つは、トランスポゾンまたはジャンピング遺伝子です。在来のトランスポゾン nDart1-0 は、従来の育種技術である逐次戻し交配により、トランスポゾンタグ付き系統、つまり GR-7895 (ジャポニカ遺伝子型) から地元インディカ品種バスマティ-370 に導入されることに成功しました。分離集団からの植物は多彩な表現型を示し、BM-37 変異体としてタグ付けされました。配列データの Blast 解析により、染色体 5 の BAC クローン OJ1781_H11 上に位置する GTP 結合タンパク質に DNA トランスポゾン nDart1-0 の挿入が含まれていることが明らかになりました。 nDart1-0 は 254 bp の位置に「A」を持ちますが、nDart1 ホモログには「G」があり、これにより nDart1-0 とそのホモログが効率的に区別されます。組織学的分析により、BM-37 の葉肉細胞の葉緑体がデンプン顆粒のサイズの減少と浸透球性プラストグロブリの数の増加によって破壊され、その結果、クロロフィル含有量とカロテノイド、ガス交換パラメーター (Pn、g、E、Ci) が減少したことが明らかになりました。）、クロロフィル生合成、光合成、葉緑体の発生に関連する遺伝子の発現レベルが低下します。 GTPタンパク質の増加に伴い、サリチル酸（SA）、ジベレリン酸（GA）、抗酸化物質含有量（SOD）、MDAレベルが大幅に増加し、サイトカイニン（CK）、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ（APX）、カタラーゼ（CAT）も増加しました。、総フラバノイド含有量（TFC）および総フェノール含有量（TPC）は、WT植物と比較してBM-37変異体植物で有意に減少しました。これらの結果は、GTP 結合タンパク質が葉緑体形成の基礎となるプロセスに影響を与えるという概念を裏付けています。したがって、生物的または非生物的ストレス条件と闘うには、バスマティ 370 の nDart1-0 タグ付き変異体 (BM-37) が有益であることが予想されます。

単子葉植物の半水生一年生草植物であるイネは、イネ科のメンバーであり、Oryza 1 属に属します。イネ属には 22 の野生分類群があり、そのうち 2 種は人間の消費にとって非常に重要です2。これらの種は、一般にアジア米として知られる Oryza sativa L. と、一般にアフリカ米として知られる Oryza glaberrima Steud です。イネ属内のいくつかの分類には、イネ、イネ、イネ、イネが含まれます。イネの 22 種の野生種のうち、15 種はアジア、7 種はサハラ以南のアフリカが起源です3。野生のイネ種は非生物的および生物的ストレス耐性などの特別な特性を備えているため、これらの種はイネの種間育種プログラムに有益です4,5。全人類の半数以上が米を食べており、米は最も重要な穀物となっています6。

さらに、イネの全ゲノム配列は非常に忠実に配列決定されており、比較的多数のトランスポゾンが発見されており、トランスポゾン研究の優れたモデルとなっている7,8。 nDart1-0 トランスポゾン (pyl-v) は、Taichung-65 (Oryza sativa japonica L.) の淡黄色の斑入りの葉を持つイネのウイルス性イネ変異体で見つかりました9。特に、活性な自律的 DNA エレメントである aDart1-27 を含む遺伝子型はトランスポゾン遺伝子を持ち、エレメント nDart1 はゲノム全体に活発に伝達されます 10。スーパーファミリー hAT に属する nDart1 エレメントは、高度な配列類似性、nDart1-0 およびよく似た非自律性コンポーネント nDart1-1 ～ nDart1-12 を持っているにもかかわらず、染色体挿入位置から切除され、他の部位に転置されます。異なる移調周波数を表示11. 活性トランスポゾンは、遺伝子にタグを付けてその機能を明らかにするために頻繁に使用されます 12、13。 nDart1 エレメントはゲノムに積極的に転置され、ゲノムの位置に統合される傾向があるため、タグ付け法は効果的なツールです。 nDart1 エレメントは、特に、推定開始コドンの 0.5 kb 前に位置するゲノムの近位プロモーターの位置に転置されます 14。 iPCR ベースの方法とトランスポゾンディスプレイ (TD) 方法も、ゲノム内の nDart1 の挿入部位を効率的に見つけるために作成されました 15,16。

イネのジャポニカ亜種とインディカ亜種は両方とも全ゲノム配列が解読されていますが、イネゲノム内の多くの機能遺伝子に関する実験研究はまだ進行中です17。どれだけの遺伝子が機能しているかを調べることは、現在最も困難な目標の 1 つです。ある特定の遺伝子の説明によれば、発生過程の多数の中間成分、すなわちシグナル伝達経路に関与するタンパク質は依然として実質的に保存されている。 G タンパク質は、これらのいわゆる分子スイッチの素晴らしい例です 18。これらのタンパク質は、固有の活性を通じて、GTP14 の結合と加水分解によってもたらされる構造変化を受けます。 GTP 結合タンパク質は真核生物と原核生物で異なり、すべての種にとって最も重要なタンパク質の 1 つです 19。 GTPase または G タンパク質は、これらのタンパク質の別名です。これは生命のあらゆる領域に存在する分子スイッチです。 GTP 分子によって「活性化」され、GTP 分子の GDP への加水分解によって「不活性化」されます。それは、細胞骨格の再構成、シグナル伝達、翻訳、転写調節、小胞輸送、タンパク質輸送などのいくつかの細胞機能を調節します20,21。 G1、G2、G3、G4、および G5 モチーフはすべての G タンパク質に存在します。これらの物質は、GTP 加水分解、GTP 構造変化、GDP/GTP 変換に必要です。 G タンパク質ファミリーでは、G2 パターンは堅牢に維持されますが、GDP/GTP 交換活動にはほとんど影響を与えません 22,23。この研究の目的は、高度に成長している地元のインディカ米品種「バスマティ-370」にトランスポゾン nDart1-0 を導入し、従来の育種手法によって変異体を取得し、ERA 様 GTP 結合タンパク質遺伝子とその活性化に対するその効果を特徴付けることでした。植物ホルモン。イネの生物的/非生物的ストレス耐性を誘導するのに役立つ可能性があります。

現在の実験に必要な繁殖材料は 2 つの異なる供給源から収集されました。パキスタン、パンジャーブ州、カラ・シャー・カクの稲研究所からのインディカ米品種バスマティ-370の種子、および国立農業研究センター（NARC）植物遺伝資源研究所からのジャポニカ系統GR-7895（nDart1-0トランスポゾンを含む）の種子、パキスタン、イスラマバード。実験データの収集は、パキスタンのイスラマバードにある国立農業研究センター (NARC) 植物遺伝資源研究所から適切な許可を得て、関連する制度的、国内的、国際的なガイドラインおよび法律に準拠していることが確認されました。バスマティ 370 に関する研究で明らかになった探索実験のデータは、バスマティ 370 には aDart 要素がまったく含まれていないことを示しています。 aDart は実際には nDart1-0 トランスポゾン要素のキャリアです。研究目的で、トランスポゾン aDart エレメントの挿入を使用して遺伝子タグ付けを行う変異体が開発されました。 GR-7895遺伝子型からのバスマティ-370上にDartエレメントを挿入するために、バスマティ-370とGR-7895の間で交配を行った。両方の系統からの乾燥成熟種子は、この目的のために表面滅菌され、ポット内の管理された環境で育てられました。交叉の開花を同期させるために、バスマティ 370 種子を 1 週間間隔で連続 4 週間栽培しました。交配はバスマティ 370 を雌親として維持して行われました。 F1種子は制御された条件下で生育し、指定されたバスマティ-370の雌植物と戻し交雑してBC1F1を生成し、この戻し交雑を継続してBC4F1を生成しました（補足資料：図S1）。 BC4F1 から収穫した種子を成長させ、自家受粉させて BC4F2 を得ました。 BC4F2 からの種子を収穫し、制御された条件下でさらに成長させて、植物の BC4F4 までの分離集団を取得し、遺伝子タグ付けに使用される異常表現型またはアルビノ表現型を同定しました。

Doyle24 によって与えられた DNA 単離のプロトコルを使用して、突然変異植物から DNA を抽出しました。次に、抽出された DNA をエッペンドルフに移しました。 7μlのRNAaseを加え、37℃で60分間インキュベートしました。 DNA の品質は 2% アガロースゲルを使用して検証され、その量は Nanodrop を使用して測定されました。次いで、サンプルを、DNA の均一かつ標準濃度になるように、50 μl dH2O あたり最大 1 μl の各サンプルまで希釈しました。次いで、ブランクサンプルとしてdH2Oを使用しながら、260nmの波長で吸光度を読み取ることによって、単離されたDNAを定量した。

メーカーのガイドラインに従って、TRIeasyTM Total RNA Extraction Reagent Kit (Yeasen Biotechnology Co., Ltd.、上海、中国) を使用して、Basmati-370 (WT) および BM-37 (変異体) のイネの葉から RNA を単離しました。 RNA の品質は 2% アガロースゲルを使用して検証され、RNA の量は Nanodrop を使用して測定されました。 cDNA は、全 mRNA に由来する改良された qRT-PCR 技術によって合成されました 25,26。特異的プライマーを用いてGTPの全長cDNAを増幅するPCRを行った。 OJ1781_H11 の全長 cDNA を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー (補足資料: 表 S1) は、イネで報告された配列 (アクセッション番号 AC120986) に基づいて設計されました。 PCR増幅された配列をクローン化し、配列決定した。配列比較とデータ分析は、NCBI データベースと blast を使用して実行されました。

我々は、Basmati-370 (BM-37) 変異体植物（幼芽期の幼芽、3 番目および 5 番目の葉、出穂期の根、茎、葉鞘、若い円錐花序、止め葉を含む）における nDart1-0 の発現レベルを調べました。植物。 nDart1 発現量を測定するために定量的 RT-PCR 検査を実施しました。光合成に関連する追加の遺伝子セット (PORA、CAO1、Cab1R、YGL1、CHLD、HEMA、PsbA、RNRS、RbcL、PsaA、RbcS、LhcpII、OsPoLP1、RNRL、FtsZ、Rpl21、RpoB、Rsp20、RpoA、OsRpoTp、および Rps7) 、葉緑体の発達とクロロフィル生合成は、qRT-PCR を介して発現レベルについて調べられました。qRT-PCR 用に設計されたプライマーは表 S2 (補足資料) に記載されています。遺伝子増幅の条件は (補足資料: 図 S2) に記載されています。

BM-37 変異体植物の葉からのゲノム DNA は、Dellaporta et al.27 に従って単離されました。すべての変異体は n1-0SPiPCR 法によって分析されました (補足資料; ファイル 1)。 PCR の条件は、95 ℃ 30 秒の活性化フェーズ、60 ℃ 30 秒の 35 サイクルの変性、72 ℃ 60 秒のアニーリング、および 72 ℃ 10 分の伸長という条件を調整しました。ソフトウェアアプリケーションPrimer_premier5を介して、トランスポゾン挿入部位の周囲の遺伝子の隣接領域からプライマーを設計することにより、トランスポゾン断片が増幅されました。

葉脈のないバスマティ-370 (WT) および変異体 (BM-37) 植物の葉サンプルをランダムに選択した苗木から採取し、2.5% グルタルアルデヒドを含む 0.1 M リン酸緩衝液 (pH 7.0) に 5 時間入れ、次に水で 3 回洗浄しました。リン酸緩衝液（0.1M、pH 7.0）。さらに、サンプルを 1% OsO4 で 1 時間後固定し、リン酸緩衝液 (0.1 M、pH 7.0) で各洗浄で 15 分間 3 回洗浄しました。次に、サンプルを段階的シリーズのエタノール (それぞれ 30、50、70、80、90、100%) で脱水し、濃アセトンを 20 分間注入し、最終的に Spurr 培地に埋め込んだ後、超薄切片に切断しました。また、極薄切片に切断したサンプルを銅ネット上に置き、透過型電子顕微鏡（JEOLTEM-1230EX）で観察した。

Arnon と Wellburn の方法に微調整を加えて分光光度計を使用し 28、29、カロテノイド (Car)、総クロロフィル、およびクロロフィル (a および b) を評価しました。簡単に言うと、三葉期の制御された環境下で生育した苗の葉からサンプル 0.2 g を収集し、エタノール:水:アセトン (4:1:5) 溶液 5 ml 中で暗所で 18 時間均質化しました。遠心分離を使用して残留粒子を除去した。 UV5100 分光光度計を使用して上清を評価しました。さらに、ポータブル光合成システム LI-6400 を使用して、蒸散速度 (E)、細胞内 CO2 濃度 (Ci)、気孔コンダクタンス (g)、および正味光合成速度 (Pn) を定量化しました。

総フェノール含有量は、没食子酸を管理化学物質として機能させ、Folin-Ciocalteu 法を使用して計算されました30。総フェノール化合物の量を示すために、FW 新鮮重量 1 グラムあたりの没食子酸当量を使用しました。カテキンを参照成分として使用し、三塩化アルミニウム技術を使用してフラボノイド濃度を測定しました31。 (gE カテキン.100 g1 FW) を使用して、全体のフラボノイド含有量を表しました。メーカーの推奨に従って、植物 ELISA キットを使用して、内因性サリチル酸 (SA)、アブシジン酸 (ABA)、ジベレリン酸 (GA)、およびサイトカイニン (CK) を検出しました。サンプル中のSA、ABA、GA、CKの濃度を測定するために、葉を液体窒素中で粉砕しました。ホルモン SA、ABA、GA、CK ELISA キットには、一連の校正標準が付属しています。次に、標準曲線をフィッティングし、サンプル内の比較可能な傾向を生成することにより、サンプル中の SA、ABA、GA、および CK レベルを測定しました。

葉のサンプルをリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.8）中でホモジナイズし、4℃、13,000 rpmで20分間遠心分離しました。次に、Zhang et al.32 の記載に従って、スーパーオキシドジスムターゼ (SOD) 活性を、ニトロブルー塩化テトラゾリウム (NBT) の 50% 光化学還元を阻害する各ユニットの能力を評価することにより、560 nm で分光測光的に測定しました。ペルオキシダーゼ (POD) 活性は、Zhou および Leul33 に従って 470 nm で測定され、グアヤコールに関連する変化は活性定数 (ε = 26.6 mm) で正規化され、カタラーゼ (CAT) 活性は Aebi34 に従って測定されました。 APX 活性は、Nano および Asada 35 に従って、アスコルビン酸塩が酸化されるにつれて 290 nm での吸光度の減少に応じて計算されました。この研究では、過酸化水素 (H2O2) を含む、植物組織内の活性酸素種を測定しました。過酸化水素含有量は、Velikova et al.36 の記載に従って測定されました。マロンジアルデヒド (MDA) 含有量は、Morales と Munné-Bosch に従って測定されました。総フェノール含有量は、参照化合物として没食子酸を使用する Folin Ciocalteu 法によって測定されました 30。フラボノイド含有量は、カテキンを参照化合物として使用する三塩化アルミニウム法によって測定されました38。

3 回の反復からの標準誤差と平均がデータの各セットについて報告されます。データ分析は、統計ソフトウェアプログラムである Statistics 8.1 を使用して実行されました。記録されたデータは、一元配置分散分析、LSD テスト、および Tukey テストを通じて分析され、p ～ 0.05 でのペアごとの有意性が決定されました。グラフの作成には Origin Pro (バージョン 8.5) が使用されました。

遺伝子の作用を研究するために、遺伝子の制御と特性評価は、リバースおよびフォワード遺伝学的アプローチにより、バイオテクノロジーおよび遺伝子工学における最も重要な遺伝的ツールとなっています。作物植物の遺伝的可能性と個体群の変動を評価するには、放射線照射、化学物質、トランスポゾン、タグ付け遺伝子の誘発遺伝子変異などを利用して突然変異体を開発し、狭い範囲からより包括的な種ゲノムの機能ゲノム評価を行う必要があります。範囲。私たちの現在の研究では、非自律性 DNA ベースの活性型イネトランスポゾン 1 (nDart1) と名付けられた、イネの活性な非自律性ゲノムまたは DNA 転移因子を記載しました。 nDart1 は、自然発生的変異性とウイルス性の性質を持つ対立遺伝子の原因となる転移因子であり、淡黄色葉斑入りまたは pyl-v です。これは、通常、非常に初期の苗の段階でイネの葉に暗緑色の縞模様を伴う淡黄色を引き起こします。イネにおけるnDart1遺伝子の発現。複数のトランスポゾンエレメントとそれらの複数の遺伝子挿入部位が存在しますが、転移因子の最大飽和を達成するために集団ゲノムにタグ付けされている特定の遺伝子の同定と特性評価の要件が緩和されているため、遺伝子型の作物系統では限られた数で発見されています。。現在の研究では、nDart1 遺伝子を選択して、淡黄色の葉に斑入りのイネ変異体を作製しました。 Basmit-370品種には、従来の戻し交配育種法によりnDart1遺伝子が挿入されました。

私たちの現在の研究研究では、nDart1 という名前の内因性で利用可能なトランスポゾンを利用して、バスマティ 370 イネ遺伝子型のタグ遺伝子の変異体を開発しました。地元のバスマティ品種では活性なnDartまたは活性な自律要素ダーツが見つからなかったため、突然変異遺伝子の戻し交配によってジャポニカ由来のaDartおよびnDart1-0をインディカ米品種バスマティ-370に導入しました。変異を示し、BC4F4 集団からの変異体としてタグ付けされた分離集団から異なる植物が選択されました (図 1A)。遺伝子解析により、この変異体は二成分トランスポゾン系によって制御されていると推測された。

分離集団からのトランスポゾン誘発変異体。 (A) 正常、復帰、安定したアルビノ実生間の表現型の違い。 (C、D) WT および BM-37 変異体の実生段階での 3 番目の葉の表現型の外観。 (D) 遺伝子のタグ付けのために分離された変異体植物。

BC4F4後の圃場でのイネの生育中、WTでは正常な緑色の葉が存在し、nDart1/aDart1を導入したBM-37では斑入りタイプのアルビノイネが存在した(図1B、C)。遺伝子発現を示した系統は、nDart1-0 ホモ接合性と、ヘテロ接合性対立遺伝子条件を有する aDart1 のような活性自律エレメントを有する劣性対立遺伝子を有すると仮定されました。突然変異系統は安定したアルビノの子孫を生み出すことがわかりました (図 1D)。安定な変異体は、安定な GTP ホモ接合性対立遺伝子が存在するだけでなく、F2 に対して 3:1 の比率で aDart1 要素を持たない対立遺伝子も存在することを示しました。また、イネ種子においては、WT と変異体との間に差異はなかったが、差異は実生の成長段階でのみ発見され、通常の種子は正常な緑色の葉と茎を生成したが、変異種子は正常な緑色の葉と茎を生成した。白い新芽と葉。結果は、イネの表現型において安定していることが見出された aDart1 エレメントの存在を示しました。 aDart1依存性のnDart1-0による対立遺伝子の体細胞切除により、イネの細胞系譜または変異個体の子孫全体にわたって発達した斑入りの葉が生成されることが判明した。しかし、白色の突然変異または斑入りの植物は、極端な条件下で肥沃な穀粒を持つ円錐花序を成長させる可能性があります。

自然な成長条件下での自然突然変異の頻度は非常に低いです。トランスポゾンは、自然な変異を作成するための遺伝子のタグ付けや機能解析に役立つため、活性なトランスポゾン源を探索するのに役立ちます。突然変異体の表現型は現場でタグ付けされ、突然変異体の表現型に斑入りの葉から DNA が単離されました。 DNA を制限消化およびセルフライゲーションに供しました。データ検索により、nDart1-0 には 13 個の相同体があり、99% を超える高い相同性があることが明らかになりました。表 S3 (補足資料) に示すように、254 bp の位置では、nDart1-0 は「A」を持ちますが、ホモログは「G」を持ちます。部位「A」は、nDart1-0 をそのホモログから区別するために効率的に使用されました。

この技術によれば、DNA は Alu I で制限され、セルフライゲーションされ、再び Bmt I による別の制限消化と、特定のプライマーを使用した iPCR による増幅を受けることに留意してください。 Alu I による消化では、nDart1-0 は塩基対「A」の置換により独自の特異的制限部位を持っているため、254 位で制限されますが、ホモログはセルフライゲーション中にこの部位に「G」を持っており、この消化されたフラグメントはnDart1-0 は、彼によって侵入された遺伝子の断片と結合します (図 2)。セルフライゲーションにより、他のフラグメントとともに nDart1-0 および nDart1-0 によって侵入された遺伝子の一部を含むいくつかの特定のフラグメントが得られます。再度、このセルフライゲーション DNA を Bmt I で制限すると、Bmt I 部位を持つ nDart1-0 が切断され、その結果、nDart1-0 が隣接する侵入遺伝子の断片が得られます。これらの断片は、nDart1-0 のフランキング領域用に設計された特異的プライマーを使用した iPCR によって増幅されました。結果を確認するために、iPCR の 2 ラウンドまたはサイクル (事前選択的および選択的遺伝子増幅と同様) が実行されました。選択的タイプの増幅では、トランスポゾンエレメントまたはその関連する特定のフラグメントのさらなる強化と濃縮は、利用可能な PCR マスターミックス製品をテンプレートとして使用し、特異的に認識されるネステッドタイプのプライマーを使用して 2 番目のトランスポーザブルエレメントの増幅を実行することによって達成されました。ゲノム内で高度に保存された転移因子領域。 nDart1-0 の特定領域に由来するプライマーにより、iPCR 中の非特異的ゲノム再構成は除外されます。一方、nDartホモログは254位にAlu I部位を持たず、この位置で消化されないため、iPCR中に特定のプライマーで増幅されません（補足資料：図S3A）。 Alu I で制限されセルフライゲーションされた DNA が iPCR のテンプレートとして使用される場合、nDart1-0 とそのすべてのホモログが増幅されますが、セルフライゲーションされた DNA が再度 Bmt I で制限される場合、この増幅は nDart1-0 に限定されます。得られた断片は、転移因子であるか検出されなかった。トランスポゾン因子の隣接配列を研究するためにトランスポーズ因子断片を増幅し、PCR増幅断片を配列決定して分析した。各断片の増幅パターンは類似しており、侵入した遺伝子の違いを除いて、nDart1-0が隣接していました。これまでのところ、BM-37変異体でnDart1-0によって侵入された12の遺伝子領域が検出されました（補足資料：表S3）。推定遺伝子の最初のエクソン領域への nDart1-0 の挿入に起因する nDart1-0 隣接配列が検出された、変異増幅断片が存在することが判明しました（補足資料：図 S3B）。

イネのnDart1-0トランスポゾンとそのホモログ。イネのnDart1-0トランスポゾンの配列。矢印はプライマーの位置を示します。矢印と制限部位はプライマーの位置を示し、赤色で強調表示されます。 TSD ターゲットサイトの重複。 TIR末端インバーテッドリピート。

私たちの研究の結果は、推定遺伝子への nDart1-0 要素の挿入とその切除が、染色体 5 上の OJ1781_H11 であることを示唆しました。配列データの Blast 解析により、染色体の BAC クローン OJ1781_H11 上の GTP 結合タンパク質遺伝子座が明らかになりました。 5 には DNA トランスポゾン nDart1-0 の挿入が含まれていることが判明しました。この遺伝子は2701 bpの塩基配列と918 cDNAを持っています。 ORFは305アミノ酸配列のポリペプチドをコードし、6つのイントロンによって中断された7つのエキソンを含む。遺伝子タグ付けの過程で、5 つの復帰変異体が見つかりました。これらの復帰突然変異表現型を分析して、トランスポゾンの有無を調べました。復帰突然変異表現型から DNA を単離し、トランスポゾンの隣接領域からすでに設計されたプライマーによってトランスポゾン挿入領域を増幅しました。増幅された断片 (図 3A、B) をクローン化し、配列を決定しました。配列分析により、トランスポゾンが挿入点から移動し、フットプリントを残したことが明らかになりました。

バスマティ 370 のいくつかの組織における nDart1-0 変異体および GTP 結合タンパク質遺伝子の転写物の PCR 増幅。(A) nDart1-0 変異体の PCR 増幅。レーン1:バスマティ370、レーン2:T-65、レーン3:日本晴、レーン4:変異性白葉、レーン5:安定白葉-1、レーン6:安定白葉-2、レーン7:安定白葉-3。 (B) バスマティ 370 のいくつかの組織における GTP 結合タンパク質遺伝子の転写物。レーン 1: 黄化した植物の葉、レーン 2: 黄化した植物の根、レーン 3: 2 週間齢の植物の葉、レーン 4: 2 週間齢の植物の根、レーン 5: 生後 2 か月の植物の葉、レーン 6: 生後 2 か月の植物の根、レーン 7: 生後 2 か月の植物の茎、レーン 8: 生後 2 か月の植物の分裂組織、レーン 9: 生後 2 か月の植物の粃、レーン 10: 生後 2 か月植物の葯、レーン11-2ヶ月の植物の柱頭。

トランスポゾン nDart1-0 の発現パターンを研究するために、いくつかの組織レベル (実生段階の 3 番目と 5 番目の葉、幼芽、葉鞘、新芽、根、出穂期の若い穂および止葉) で qRT-PCR を実行しました。 BM-37の変異体。分析したすべての組織にわたって、5 番目の葉および止葉と比較して、実生の 3 番目の葉の段階で最も高い発現が見られ、初期の実生の葉が他の組織よりも高い発現を示した。茎、鞘、根を含む組織の発現レベルは葉よりも大幅に低く、一方、若い穂と幼芽ではBM-37の発現レベルがわずかでした（図4）。この発見は、nDart1-0 が、特に苗の初期段階における葉の葉緑体の発達に影響を与える役割を持っていることを示唆しました。

BM-37 変異体におけるさまざまな組織の発現研究のための転写レベル。プラムル。苗の段階で3〜3番目の葉。苗の段階では5〜5枚目の葉。 YR-若い根。茎、鞘、FL-旗葉、YP-若い穂。すべての値は、5 回の反復の平均 ± SD を表します。エラーバーの上の異なる文字は、p ≤ 0.05 での治療間の有意差を示します。

TEM を使用して、WT および BM-37 変異体植物の葉緑体の超微細構造変化を調べるために分げつ段階の葉の上部を研究しました。よく発達したラメラ構造を示したBM-37葉緑体とは対照的に、WT植物のグラナラメラスタックはまばらで、密度もまばらでした。これは、BM-37 変異が生物発生に重大な影響を与えたことを示唆しています。この結果は、デンプン顆粒が WT には正常に存在するにもかかわらず、BM-37 変異体の葉緑体中に存在するのが難しいことも示しました (図 5A、B)。 BM-37 変異体では、WT よりも多くの浸透圧性プラストグロブリ (OP) が存在し、クロロフィル代謝が実質的に損なわれていることを示しています。

WT および BM-37 変異体の植物の葉緑体の TEM 画像 (A および B)。 G、グラナスタック。 OP、浸透圧性プラストグロブリ。 SG、デンプン顆粒。

WT および BM-37 植物の実生期および出穂期で、カロテノイドおよびクロロフィルの含有量を調べて、光合成色素代謝に対する nDart1-0 トランスポゾンの影響を確認しました。クロロフィル (a、b、および a + b) 含有量とカロテノイドレベルは、WT と比較して実生段階の BM-37 で大幅に減少しました。しかし、クロロフィル含有量とカロテノイドは、WT および BM-37 変異体植物の両方において出穂期で有意ではない結果を示しました（図 6A、B）。さらに、ガス交換パラメータを測定して、WT 植物と BM-37 変異体植物の光合成特性を比較しました。 WTと比較して、BM-37変異体は光合成活性（Pn）、気孔コンダクタンス（g）、細胞間CO2濃度（Ci）、および蒸散（E）の速度を劇的に低下させた（図6C〜F）。

クロロフィル色素含有量、カロチノイド含有量、光合成パラメータの解析。 (A) BM-37 変異体および WT の実生段階の葉のクロロフィルおよびカロテノイド含有量。 (B) BM-37 変異体および WT の出穂期の葉のクロロフィルおよびカロテノイド含有量 (C) 正味光合成速度 (Pn)。 (D) 気孔コンダクタンス (g); (E) 細胞間 CO2 濃度 (Ci)。 (F) 蒸散速度 (E)。すべての値は、5 回の反復の平均 ± SD を表します。 Tukey の検定によると、アスタリスクは統計的有意水準 (*p < 0.05) を示します。

WT 植物および BM-37 変異体植物において、葉緑体の発生、光合成、およびクロロフィル生合成に関連するさまざまな遺伝子の発現レベルが実生段階で評価されました。結果は、遺伝子がクロロフィルの生合成に関連していることを示しました。 PORA、CHLD、YGLI、CAO1、および HEMA を含む遺伝子、および RbcS、Cab1R、PsaA、PsbA、RbcL、および LhcpII などの光合成関連遺伝子は、WT 植物よりも pyl-v37 変異体植物で有意に下方制御されていました (図 7A、 B)。

BM-37変異体およびWT植物における(A)クロロフィル生合成、(B)光合成、(C)葉緑体の発生に関連する遺伝子の定量的発現解析。各遺伝子の発現レベルはqPCRによって解析されました。

また、RpoA、RpoB、OsRpoTp、Rps7、Rps20、RNRL、RNRS、OsPolP1、FtsZ、Rpl2141、42、43、44、45、46など、葉緑体の発生に関連するさまざまな遺伝子の発現レベルも研究しました。葉緑体の発生に関連するすべての遺伝子の相対発現レベルは、BM-37変異体においてWT植物と同等に有意に下方制御されていた(図7C)。非生物的ストレス下では、これらの重要な遺伝子の異常な発現が変異表現型を引き起こした可能性があります。この発見は、BM-37 変異が BM-37 変異細胞におけるクロロフィルの代謝、光合成、および葉緑体の発達に重大な影響を与えていることを示しました。

BM-37 変異体と実生段階の WT 葉を使用して、植物内の SA、CK、GA、ABA などの最も一般的な成長関連植物ホルモンのレベルを評価しました。所見によれば、BM-37変異体ではWTに比べてCKレベルが大幅に低く、GAおよびSA含量が有意に高かったが、ABAレベルはWTのものと有意な差はなかった（図8A〜D）。この発見によると、BM-37変異体は葉緑体形成のための効率的なホルモンシグナル伝達を示した。

BM-37 変異体および WT における内因性植物ホルモン、酵素的抗酸化物質、低分子量抗酸化物質 (LMWA)、および活性酸素種 (ROS)。 (A) CK-サイトカイニン。 (B) ABA-アブシジン酸; (C) SA-サリチル酸および(D) GA-ジベレリン酸。 (E) SOD-スーパーオキシドジスムターゼ。 (G) APX-アスコルビン酸ペルオキシダーゼ。 (I) POD-ペルオキシダーゼ; (K) CAT-カタラーゼ。 (F) TFC-総フラボノイド含有量。 (H) TPC の総フェノール含有量。 (J) H2O2-過酸化水素および(L) MDA-マロンアルデヒド含有量。すべての値は、3 つの生物学的複製の平均 ± SD です。 * Tukey の検定による p < 0.05。

また、WT と BM-37 変異体の比較のための抗酸化物質の活性を研究するために、H2O2 生成や MDA 含有量などの ROS、および低分子量抗酸化物質や酵素的抗酸化物質などのスカベンジャー抗酸化物質も評価しました（図 8E- L）。 CATやAPXのような酵素的抗酸化物質は、BM-37の葉では著しく低いのに対し、WTの葉ではSODがかなり高いため、酸化性化合物を除去する可能性がある(図8E、G、K)。 MDA レベルは WT 植物よりも BM-37 植物で大幅に増加し (図 8L)、変異体の葉がより酸化的損傷を受けていたことを示しています。結果はまた、BM-37 と H2O2 および POD の WT 値の間に目立った変化がないことも示しました (図 8I、J)。結果は、TFCおよびTPCの値もWT葉と比較してBM-37変異体葉で有意に減少していることも示した(図8F、H)。この研究では、欠陥のある葉緑体によって生成されるROSを除去する効果がWTよりも低いため、BM-37は抗酸化防御が不十分であることが判明した。

遺伝子タグ付けの場合、T-DNA、Tos17、またはトウモロコシトランスポゾン、Ac/Ds および En/dSpm による挿入突然変異誘発は非常に有用ですが、主な欠点は体細胞クローン変異が頻繁に存在することです。内因性レトロトランスポゾン Tos17 による遺伝子タグ付けの頻度は非常に低いです 47,48。内因性 DNA TE の挿入による突然変異は、トランスポゾンタグ付き突然変異リソースを生成するために望ましいです。内因性 DNA TE の唯一の欠点は、フットプリントによって誘導される安定した変異体が生成されることです。この場合、変異遺伝子を同定することは困難である。これまでに、組織培養技術 49,50 とガンマ線照射 51,52,53 を通じて、イネのゲノム内で観光客のような MITE ファミリーメンバーである mPing を再活性化する取り組みが行われてきました。 mPing の挿入は TTA または TAA の標的部位 (TSD) の重複を誘導し、mPing は通常、非コード領域またはイントロンに挿入される傾向があるため、mPing は優れたトランスポゾンタグ付けツールとは考えられていませんでした。一方、DNA TE、nDat1-0 はイネから発見されました9。構造的には、nDart1-0 は、サイズが小さく (607 bp)、GC が豊富 (約 72%) の非自律活性 DNA トランスポゾンであり、遺伝子領域に転移する傾向があり、末端の 19 bp の完全なセグメントを保持しています。逆方向反復配列（TIR）は、通常 8 bp の高さの GC 標的部位重複を持ち、hAT スーパーファミリーに属します 54,55。 OsClpP5 に挿入された nDart1-0 は、他の 2 つの遺伝子にも侵入することが判明し、遺伝子タグ付けの効率が高いことが示されました 9。ブラスト検索により、日本晴とインディカ品種 9311 がそれぞれ 13 個と 7 個の nDart1 ホモログを保有していることが明らかになりました。遺伝子タグ付けのための効率的な nDart1-0 の利用は、通常、そのイネ品種における aDart の存在または発生に依存します。日本晴が自律素子aDart56の候補を63個搭載していることが観察された。これらの特有の特徴により、nDart1-0 は、DNA 内の非自律的転移因子に関する最近および以前の研究および発見のほとんどと区別されます。

転移因子は、これらの要素がイネ品種で発現された場合、斑入りまたはアルビノ植物を引き起こしました57。トウモロコシとキンギョソウでは、トランスポゾンタグ付け遺伝子が報告されており、さまざまな範囲の転移遺伝子または要素とともに単離に成功しています58、59、60。そこで、nDart1-0 の侵入によって変異した遺伝子にタグを付ける戦略を開発しました。 iPCR (n1-0SPiPCR) を使用して新しく開発された戦略は、nDart1-0 固有のタグ付けシステムに役立ちます。このシステムにより、トランスポゾンエレメントは通常、トランスポゾンの特定の配列から開始し、制限のための特定の部位に隣接する配列の一部を増幅する制限-ライゲーション-制限媒介による逆PCRによってタグ付けされます。得られた PCR 産物は、クローン化、分析、または配列決定に使用できます 61、62、63。これまでの研究では、aDart と nDart1-0 の両方がジャポニカ米とインディカ米の遺伝子タグ付けに有用なツールであることが判明したと詳しく説明されています。我々は、宿主細胞ゲノムから活性トランスポゾンエレメントnDart1-0を単離するための十分に確立された体系的かつ計算的アプローチを利用することが、イネにおける転移因子の遺伝パターンを理解するのに役立つ可能性があることを発見した64,65。しかし、この技術はnDart1-0を迅速に検出する方法であるだけでなく、イネゲノム内のさまざまな遺伝子の遺伝子タグ付けにも利用されています。

アルビノまたは斑入りの突然変異植物は、色素体の成長と発達に関する重要かつ貴重な情報を提供します。致死性の高い表現型効果のため、それらの遺伝子解析は困難でした66。本研究から、nDart1-0-iPCR と名付けられた最近開発された手法を利用することにより、変異した対立遺伝子を同定することに成功しました。 nDart1/aDart1 系統のタグ付けから、この系統には最も頻繁に繰り返される転移因子 nDart1-0 が含まれている一方、他の系統には nDart1 転移因子が含まれていることが判明しました 67,68。 nDart1 転移因子は遺伝子のプロモーター領域内に組み込まれる挙動を示すことがわかっています 69。また、nDart1-0の挿入が、GTP遺伝子の開始ATGコドンから13bp下流のGTP遺伝子の変異の原因となることも判明した。 GTP 遺伝子転写開始点の下流に nDart1-0 が挿入されることにより、GTP 遺伝子にフレームシフト変異が存在しました。以前の研究実験の結果から、転写開始部位への nDart1 の挿入が下流の遺伝子部位の発現レベルに影響を与えることも明らかになりました。 OsClp5 は、pyl-v 変異体 70 の nDart1 トランスポゾンの 5'-UTR 位置への挿入により破壊された効果を示しています。突然変異イネ系統は花序の増加および強化を示すことが判明し、nDart1-0 の挿入により、イネにおける Aberrant Panicle Organization1 などの遺伝子名の下流部位からの遺伝子発現レベルが上昇制御される可能性があることが示されました 71,72,73。

さまざまな研究研究から、GTP タンパク質は葉緑体の生合成にはより多くの量が必要ですが、エチオプラストの生合成にはより少ない量が必要です。 GTP の翻訳効率は、葉緑体発生中にエチオプラストから活性化されることがわかっています。色素体の細胞分裂は主に P0 から P4 成長段階の非常に初期までに起こりましたが、光合成装置の活性化はイネリアンの P4 成長段階で見出されています 74,75,76。私たちの現在の研究は、色素体の十分に確立された遺伝システムにより、GTP タンパク質が葉緑体のチラコイド膜の発達中に機能することを示唆しています。非緑色植物組織では、葉緑体発達中の GTP タンパク質の存在量と蓄積が転写後レベルで調節されていることも判明しています。

nDart1-0が挿入されたBM-37変異体は、苗の段階でカロテノイドとクロロフィルの含有量が低く、色素の大幅な減少はおそらく葉緑体の発達と最終的には光合成プロセスに影響を与えると考えられます（図6A）。透過型電子顕微鏡により、nDart1-0 遺伝子の変異による BM-37 の超微細構造変化が確認されました (図 5)。 BM-37ではより多くのプラストグロブリの数が観察され、これは変異体がチラコイド膜生合成に欠陥を持ち、その形成がチラコイドの酸化損傷を防ぐ場合にプラストグロブリの数が増加するという以前の研究と一致している77。 BM-37 では、葉緑体にはより小さなデンプン顆粒が含まれており、デンプン形成が妨害され、葉緑体発達のためのエネルギー供給に影響を与えていることが示されました 78。さらに、BM-37 変異体のクロロフィル含有量の減少により、正味の光合成速度、気孔コンダクタンス、蒸散速度、細胞間 CO2 濃度などの重要な光合成パラメーターが減少しました (図 6C-F)。これは、ガスが存在する変異体でも観察されました。交換パラメーター (Pn、Tr、g、Ci) は、クロロフィル含量の減少に伴って減少しました 79。さらに、BM-37変異体の葉緑体発生、クロロフィル生合成および光合成に関与する遺伝子の転写レベルが低下していること（図7A〜C）は、nDart1-0の変異が色素体から核への逆行性シグナル伝達を妨害しているという証拠を提供した。これは、葉緑体の逆行性シグナル伝達がシロイヌナズナの spc1 変異体でも破壊されているという以前の発見と一致しています80。総合すると、これらの結果は、BM-37 の変異が葉緑体の発達と光合成効率に関連していることを示しました。

実生段階のBM-37変異体植物は、クロロフィルおよびカロテノイド含有量の大幅な減少をもたらし、葉緑体の発達障害を引き起こし、より高いROSを蓄積する可能性があります。カロテノイドは、過剰なフリーラジカルと活性酸素種 (ROS) を解毒することにより、光酸化損傷から保護します 81。例えば、斑入りイネゼブラ 225 における葉緑体生合成の障害、および赤色クロロフィル異化代謝物還元酵素 82 をコードする ACD2 における変異は、ROS の過剰な蓄積を引き起こしました。植物は、スーパーオキシドに対処するために SOD などの ROS を解毒する抗酸化酵素を生成し、一方で CAT、POD、APX は H2O2 を除去します。さらに、非酵素的抗酸化物質は、より高い ROS レベルの下でモノデヒドロアスコルビン酸に酸化される可能性があることが報告されています 83。したがって、我々の結果は、BM-37変異体植物における非酵素的抗酸化物質の含有量が低いことを示した(図8F、H)。したがって、結果は、ROS 消去酵素の機能不全と、葉緑体の発達障害による H2O2 と MDA の蓄積が、実生段階の BM-37 変異体に黄色の葉色をもたらしたと推測しました。

さまざまな非生物的ストレス下では、作物で活性酸素種（ROS）と脂質過酸化が生成され、細胞に損傷を与え、作物の死につながります。成長の低下は、植物細胞の細胞および細胞内の異常によって引き起こされます84、85、86。作物の各細胞は、細胞内、特に葉緑体とミトコンドリアの自己防御機構を誘導する抗酸化物質 (SOD、POD、CAT、APX) を生成する能力を持っています 87,88。活性酸素種 (H2O2) は主に葉緑体とミトコンドリアの膜に影響を与え、最終的には細胞死を引き起こします。ペルオキシダーゼ (POD)、カタラーゼ (CAT)、グアヤコールペルオキシダーゼ (GPOD)、過酸化水素 (H2O2)、スーパーオキシドジスムターゼ (SOD)、リポキシゲナーゼ (LOX)、カタラーゼ (CAT)、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ (APOD) およびグルタチオン S の生成-トランスフェラーゼ (GST)、グルタチオン、プロリン、アスコルビン酸などは、細胞内で生成される生体有機化合物です89,90。 GTP タンパク質は、これらの抗酸化物質がさまざまな条件下で機能するための環境を提供します。 GTP タンパク質は、ストレス条件と戦う必要がある細胞に局在しています。植物ホルモン調節と G タンパク質シグナル伝達に関するさまざまな研究を調査すると、それらの機能的役割におけるいくつかの興味深い類似点が明らかになりました。さらに、シロイヌナズナの G タンパク質変異体は、さまざまな植物ホルモンに応答して変化した表現型を示し 91,92、トランスクリプトームデータから、さまざまなホルモン処理下で G タンパク質遺伝子の発現に大きな変化が見られることが明らかになりました 93。これらの研究から、トランスポゾン nDart1 は、 -0 は、機能遺伝子解析用の変異体を開発するための有用なシステムであり、n1-0 SPI PCR は、トランスポゾン nDart1-0 の挿入によって開発された変異体を分析するための強力なツールです。 GTP 結合タンパク質の転写物は、植物のさまざまな組織、通常は植物の初期段階で観察されました。 Era 様 GTP 結合タンパク質は古いファミリーの新しいメンバーであり、葉緑体の生合成と植物の生存に不可欠です。

これらの研究は、トランスポゾン nDart1-0 は遺伝子機能解析のための変異体を開発するための有用なシステムを開発するための有用なシステムであり、n1-0 SPI PCR はトランスポゾン nDart1-0 の挿入によって開発された変異体を分析するための強力なツールであると結論付けています。 GTP 結合タンパク質の転写物は、さまざまな植物組織、通常は植物の初期段階で観察されました。 Era 様 GTP 結合タンパク質は古いファミリーの新しいメンバーであり、葉緑体の生合成と植物の生存に不可欠です。記載されているプロトコルは、トウモロコシなどの植物を含む他の生物から転移因子を特定するための潜在的な方法として役立つ可能性があります。しかし、この技術は、nDart1-0 を検出する迅速な方法だけでなく、イネゲノム内のさまざまな遺伝子の遺伝子タグ付けにおけるその利用についても説明することが期待されていたかもしれません。

生成または分析されたすべてのデータは、原稿および補足ファイルで提供されています。

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この研究は、中国浙江省科学技術局（プロジェクト番号2021C02063-6）の支援を受け、米国DOE科学局、生物環境研究局（BER）の助成金番号DE-の支援を受けました。 SC0006634 および DE-SC0012379

浙江大学農学部、杭州、310058、浙江省、中国

サナウラ・ジャリル、アサド・ウラ・カーン、ムハンマド・ムダシル・ナジル、シャラファト・アリ、シャオリ・ジン

作物科学研究所、国立農業研究センター、イスラマバード、44000、パキスタン

サナウラ・ジャリル

パンジャブ大学農学部植物育種遺伝学科、ラホール、54590、パキスタン

クルバン・アリ & モハメド・アルシャド・ジャベド

バハーワルプル・イスラム大学農業環境学部園芸科学科、バハーワルプル、63100、パキスタン

ファイサル・ズルフィカール

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SJ、概念化、調査、原案作成。 QA、概念化、調査。 AUK、FZ、SA、MAJ、MMN、レビュー、編集。正式な分析。 XJ、監修、執筆、校閲、編集。著者全員が原稿をレビューしました。

Xiaoli Jinへの対応。

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転載と許可

ジャリル、S.、アリ、Q.、カーン、AU 他従来の nDart1-0 トランスポゾン遺伝子の組み込みを通じてイネの分子的および生化学的特性評価が開発されました。 Sci Rep 13、8139 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35095-7

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受信日: 2022 年 7 月 21 日

受理日: 2023 年 5 月 12 日

公開日: 2023 年 5 月 19 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35095-7

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