リソソーム

Apr 13, 2023

Nature Communications volume 14、記事番号: 2654 (2023) この記事を引用

1064 アクセス

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）は、その発生率の高さから大きな注目を集めています。今回我々は、広範なバイオインフォマティクス解析を通じて、リソソーム関連タンパク質膜貫通5（LAPTM5）がNASHの進行と関連していることを示す。 LAPTM5 のタンパク質レベルは、NAS スコアと負の相関関係があります。さらに、LAPTM5 の分解は、E3 ユビキチンリガーゼ NEDD4L によるユビキチン化修飾を介して媒介されます。雄マウスで行われた実験によって、肝細胞特異的な Laptm5 の枯渇がマウス NASH 症状を悪化させることが発見されました。対照的に、肝細胞における Laptm5 の過剰発現は、正反対の効果を及ぼします。機構的には、LAPTM5 は CDC42 と相互作用し、パルミチン酸の刺激下でリソソーム依存的にその分解を促進し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼシグナル伝達経路の活性化を阻害します。最後に、アデノウイルスを介した肝臓の Laptm5 過剰発現は、NASH モデルにおける前述の症状を改善します。

非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）は、肝脂肪変性、肝細胞のバルーニング、小葉および肝臓の炎症、間質性線維症によって病理学的に特徴付けられます1、2。肝硬変および肝細胞癌 (HCC) の進行の主な原因として、NASH は非アルコール性脂肪肝疾患 (NAFLD) 患者の 5 人に 1 人を占めており、最近の調査によれば、世界の成人人口の約 25% が罹患していると推定されています。レポート3、4。残念ながら、NASH の発症と進行を防ぐ効果的な治療法は依然として限られており、これまでのところ、FDA が承認した薬物療法は利用できません 5,6。 NASH の分子標的は、治療応用の可能性が高いため、ますます注目を集めています 7。

近年、疾患の進行におけるリソソーム関連制御の役割が活発な研究の対象となっています。実際、リソソームは細胞の老廃物を分解してリサイクルする機能があるだけでなく、タンパク質の分解、栄養素の感知、自然免疫および適応免疫に関与する重要な細胞小器官であると報告されています8,9。そしてこれまでのところ、リソソームは複数のシグナル伝達経路と相互作用し、アテローム性動脈硬化症、神経変性疾患、自己免疫疾患、リソソーム蓄積障害などの多くの疾患の進行を制御していることが証明されています。一方、プロテオスタシスシステムによって調節されるタンパク質分解は、薬物ターゲティングの魅力的なプラットフォームであり、ヒトの幅広い生理学的活動において重要な役割を果たしていると考えられている10,11。

LAPTM4A、LAPTM4B、および LAPTM5 で構成される LAPTM ファミリーは、タンパク質輸送およびリソソーム分解における役割のため、近年集中的に研究されており、疾患介入の特別なターゲットとして機能する可能性があります。リソソーム関連タンパク質膜貫通 5 (LAPTM5) は、後期エンドソーム/リソソーム膜貫通タンパク質ファミリー 12 に属し、当初はタンパク質恒常性の調節因子 13,14 および炎症性シグナル伝達経路の調節因子 15 として同定されました。 LAPTM5 は、MAPK シグナル伝達経路の活性を調節することにより心肥大を改善します16。私たちの以前の研究 17,18 と他の研究者による研究 19,20 では、MAPK シグナル伝達経路の活性化が NASH の発症と進行に密接に関連していることが示されました。いくつかの予備的な発見を前提として、この研究はLAPTM5がNASHの進行に関与しているという仮説に基づいて実施されました。

この研究では、LAPTM5 のタンパク質発現がヒト NASH 被験者とマウス NASH モデルの両方の肝臓で大幅に下方制御されていることを実証しました。肝細胞におけるLAPTM5の枯渇は、高脂肪高コレステロール（HFHC）食誘発マウスNASHモデルにおいて肝脂肪症、炎症、および線維症を著しく悪化させたが、肝細胞におけるLAPTM5の過剰発現は、前述の病理学的変化を実質的に遅らせ、軽減した。さらに、LAPTM5 が細胞分裂周期 42 (CDC42) タンパク質と直接相互作用する可能性があり、LAPTM5 の過剰発現がパルミチン酸刺激環境下でのリソソーム分解を促進することも発見しました。一方、LAPTM5 発現が低下すると、CDC42 の発現が大幅に上方制御され、これはマウスとヒトの両方の NASH 組織で確認されています。その結果、肝細胞における脂質沈着および代謝に対する LAPTM5 の保護効果、および MAPK シグナル伝達経路の活性化阻害は、CDC42 の過剰発現によって大幅に無効になる可能性があります。さらに、LAPTM5のノックアウトによる肝細胞の脂質沈着は、CDC42のノックダウンによって有意に抑制されたことから、LAPTM5がCDC42のタンパク質発現を調節してMAPKシグナル伝達経路の活性を媒介することによってNASHの進行を調節していることが示唆された。アデノウイルス媒介療法も NASH 症状を大幅に改善する可能性があります。まとめると、これらの発見は、LAPTM5が機構的にNASH進行の調節因子として機能し、臨床的にはNASH進行の指標およびNASH治療の標的としても機能する可能性があることを明らかにした。

NASH は病態生理学的に複雑で多因子ですが、多数のタンパク質が NASH の制御に関与していることがわかっています。どのタンパク質がNASHの病因において最も重要な決定因子であるかを知るために、我々はNASH被験者の肝臓サンプルからRNA-Seqの10の臨床データベースを検索し、リソソーム、特定の顆粒およびアズロフィル顆粒内腔に存在する3つの保存されたタンパク質を検索した。 10 の臨床データベースすべてに含まれています (図 1a ～ c)。注目すべきことに、疾患の重症度はリソソームに局在するタンパク質の発現と最も密接に相関しています（図1d）。マウス肝臓の RNA-Seq の 5 つのデータベースの検索結果もこの結論を裏付けました (図 1e)。疾患の進行における膜貫通タンパク質の重要な役割を考慮すると、上記のリソソーム関連タンパク質の中で 71 個の膜貫通タンパク質が同定されました。これらの遺伝子の脂質プロファイルに対する効果を評価するためにハイコンテントスクリーニング分析が行われ、その結果、LAPTM5がPA刺激時の肝細胞脂質蓄積に対して最も強い阻害効果を有することが示されました（図1f）。 LAPTM5 と NASH の相関関係を調査するために、まず脂肪変性のないヒト被験者または NASH のあるヒト被験者の肝臓における LAPTM5 のタンパク質発現を測定しました。肝臓の LAPTM5 タンパク質レベルは、NASH 患者では非脂肪症患者よりも大幅に下方制御されていることがわかりました。 -NASH 対応物 (図 1g および補足図 1a、b)。免疫組織化学の結果と組み合わせると、LAPTM5のタンパク質レベルがNASスコアと負の相関があることがわかりました（図1h、i）。ヒトでの我々の観察と一致して、高脂肪食（HFD）、高脂肪高コレステロール食（HFHC）、またはメチオニンを与えられたob/obマウスおよび野生型マウスの肝臓では、LAPTM5タンパク質の発現が大幅に減少しました。コリン欠乏食（MCD）（図1jおよび補足図1c〜e）。さらに、インビトロ実験では、PA処理後のL02ヒト肝細胞とマウス初代肝細胞の両方でLAPTM5タンパク質発現が時間依存的に劇的に減少することが実証されました（補足図1f、g）。その後、NASH または非 NASH における Laptm5 の遺伝子発現が qPCR によって検出され、その結果、予想外にも、Laptm5 の mRNA レベルが in vivo モデルと in vitro モデルの両方で同等であることが示され、LAPTM5 が転写後に調節されていることを示しました。代謝刺激に対する反応（補足図1h〜j）。まとめると、LAPTM5 発現と NASH 発症との間に顕著な負の相関があることは、LAPTM5 が症状の進行遅延に役割を果たしていることを示唆しています。

a GSE は、臨床 NASH 患者および健康な患者または健康な肥満患者のヒト肝臓の RNA 配列に由来します。 10 以上の GSE データ間で共有される遺伝子カテゴリは黒い点で示されます。各プロット上のヒストグラムは、各カテゴリ内の活性化遺伝子カテゴリの時間を示します。 b 円グラフは、GSE を共有する遺伝子カテゴリの統計表現を示しました。括弧内の整数は遺伝子カテゴリーを表し、括弧外は共有される GSE の数を表します。 c 10 のヒトデータベースにおける 3 つの保存遺伝子カテゴリーの NES ドットプロット。 d データベースに保存されているこれら 3 つの遺伝子の GSVA スコア分析。 e マウス肝臓の 5 つのデータベースの NES 分析。 f 71分子過剰発現を伴うL02細胞のナイルレッド蛍光強度の定量分析（n = 3の独立した実験）。 g NASH (n = 20 人) または非 NASH グループ (n = 16 人) のヒト肝臓における LAPTM5 タンパク質レベルの代表的なウェスタンブロット分析 (左) と定量 (右)。 h 示されたグループのヒト肝臓切片における LAPTM5 の免疫組織化学的染色 (n = 5 人/グループ)。スケールバー、50μm。 i LAPTM5 タンパク質レベル (β-アクチンレベルに正規化) と NAS の間の相関分析 (r2 = 0.6964、p < 0.0001)、(n = 36 人)。 j 通常の固形飼料を与えられたマウスおよびHFHC食を与えられたマウスの肝臓における代表的なLAPTM5タンパク質レベル（n = 6マウス/グループ）。 (d) の場合、データはひげプロットとして表示されます。正中線、中央値。ボックス、25 ～ 75 パーセンタイル。ウィスカー、最小値から最大値まで。 f、g、j については、データは平均 ± SD として表示され、統計分析には両側スチューデント t 検定が使用されました。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

NASHにおけるLAPTM5タンパク質の下方制御の根底にある機構をさらに調査する。細胞内タンパク質はユビキチン - プロテアソーム系またはオートファジー経路を通じて分解される可能性があり 24、パルミチン酸 (PA) で刺激された肝細胞ではさまざまな経路の阻害剤が処理され、LAPTM5 のタンパク質分解はプロテアソーム阻害剤 MG132 によって回復されることが報告されています。一方、リソソーム阻害剤Chlqはサルベージに役割を果たしませんでした。 (図2a、b)。次に、LAPTM5の分解に関与している可能性のあるタンパク質がIP質量分析で検出され、NEDD4L、NEDD4、WWP2、およびITCHが法案に適合することが判明しました（図2c）。質量分析の結果はCO-IPテストによって検証され、NEDD4LはLAPTM5と最も強い相互作用を示しました（図2d）。一方、NEDD4Lの過剰発現はLAPTM5の分解に対して最も強い促進効果を持ち（図2e）、NEDD4LがLAPTM5タンパク質分解の主要な調節因子であることを示唆しています。次に、LAPTM5とNEDD4Lの間の相互作用は、CO-IPおよびGST沈殿アッセイによってin vitroでさらに確認されました（図2f、g）。 LAPTM5 分解を媒介する NEDD4L の機構をさらに理解するために、IP アッセイを実施して LAPTM5 のユビキチン化を調べました。 LAPTM5のユビキチン化はNEDD4Lが過剰発現すると著しく増強されましたが、この修飾はNEDD4L不活化後にブロックされました（図2h、i）。我々の結果は、LAPTM5の分解がK48関連ユビキチン化を介してNEDD4Lによって媒介されることを示した（図2j、k）。さらに、分解はNEDD4LのE3リガーゼによって促進されることを証明しました（図2l）。さらに、NEDD4L のノックダウンにより LAPTM5 分解の回復に成功しました (図 2m)。さらに、NASHグループではNEDD4Lのタンパク質レベルが対照グループと比較して大幅に上方制御されていることがわかり、これはヒトNASH被験者、マウスNASHモデル、およびPAで刺激された肝細胞の両方で検証されました（補足図2a〜e）。。その結果、NEDD4L も NASH によって制御されていることが証明されました。

aおよびbは、MG132（50μM）、Chlq（50μM）、またはDMSOで処理したマウス肝細胞（a）およびL02肝細胞（b）におけるLAPTM5タンパク質レベルのウェスタンブロット画像。 c IP-MSを分析することにより、LAPTM5と相互作用するE3ユビキチンリガーゼを同定する手順。 d L02細胞におけるLAPTM5とNEDD4L、NEDD4、ITCH、WWP2との相互作用。 e ウェスタンブロットは、示されたプラスミドでトランスフェクトされた後の LAPTM5 の発現を示します。 f および g Co-IP (f) および GST プルダウン (g) は、LAPTM5 と NEDD4L の間の相互作用を示しています。 h Co-IP の結果は、MG132 (25 μM) 処理後の LAPTM5 のユビキチン化に対する NEDD4L の効果を示しています。 i 異なる処理後の LAPTM5 のユビキチン化の Co-IP アッセイ。 j 示された種類のユビキチンを使用した NEDD4L による LAPTM5 のユビキチン化スクリーニング。 (k) 示されたプラスミドでトランスフェクトされたL02肝細胞におけるLAPTM5のユビキチン化。 l 示されたプラスミドでトランスフェクトされたL02細胞におけるLAPTM5タンパク質レベル。 m 初代肝細胞におけるNEDD4Lのノックダウン後のLAPTM5発現変化のウェスタンブロット結果。イムノブロットは 3 つの独立した実験の代表です。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

肝細胞における脂質代謝と炎症に対する LAPTM5 の影響を調べるために、Laptm5 ノックアウト (Laptm5-KO) マウスと Laptm5-Flox コントロールマウスから初代肝細胞を単離しました。この初代肝細胞には、Laptm5 (AdLaptm5) を過剰発現するアデノウイルスベクター媒介プラスミドが感染しています。 -フラグ）（図3aおよび補足図3a）。ナイルレッド染色（図3bおよび補足図3b）により、Laptm5-KOグループにおけるPAOA誘発性肝細胞脂質蓄積が対照グループと比較して著しく悪化し、トリグリセリド（TG）および総コレステロール（TC）濃度の上昇を伴うことが明らかになりました。 (図3b、c)。対照的に、肝細胞におけるLaptm5の過剰発現は、PAOA誘発性の脂質沈着を改善しました（補足図3b、c）。また、BSA 治療群では肝細胞の脂質沈着に有意差は観察されませんでした。さらに、脂質代謝と炎症に対するLAPTM5の阻害効果は、qPCRとウェスタンブロッティングによってさらに確認されました（図3d–gおよび補足図3d–g）。さらに、RNA-seqデータに基づいて、階層的クラスタリング分析により、PAOA処理サンプルがLaptm5-Flox-PAOAとLaptm5-KO-PAOAの2つのサブグループに明確に分類されました（図3h）。 Laptm5ノックアウトが脂質代謝と炎症に関連する生物学的プロセスを誘発したことは注目に値します（図3i-k）。全体として、この in vitro 証拠は、LAPTM5 が肝細胞における代謝ストレス誘発性の脂質蓄積と炎症に対して保護効果を発揮することを示唆しています。

a Laptm5 ノックアウト (KO) マウスまたは WT マウスから単離された肝細胞における LAPTM5 タンパク質レベル (n = 3 マウス/グループ)。 b および c 示された刺激後の初代肝細胞におけるナイルレッド染色 (b) および TG、TC 含量 (c)。スケールバー、25 μm、(n = 3 回の独立した実験)。 d および e 相対的な mRNA (n = 4 マウス/グループ) (d) およびタンパク質 (n = 3 マウス/グループ) (e) 示されたグループにおける脂肪酸代謝に関連するマーカーのレベル。 f および g 示されたグループにおける炎症に関連するマーカーの相対的な mRNA (n = 4 マウス/グループ) (f) およびタンパク質 (n = 3 マウス/グループ) (g) レベル。タンパク質発現はβ-ACTINに対して正規化しました。 h WT マウスおよび Laptm5-KO マウスから単離された PAOA 刺激初代肝細胞からの RNA-seq データの階層的クラスタリング分析。 (ik) GSEA 経路濃縮分析とヒートマップは、脂質代謝と炎症の経路の活性化と遺伝子発現を示します。 PAOA、0.5 mM/1.0 mM; PA、0.5 mM、OA、1.0 mM。すべての統計分析について、結果は平均値 ± SD として表されます。 Bonferroni 事後検定 (c、d-Scd1、d-Srebf1、および f-Tnf) および Tamhane T2 事後検定 (b、d-Fasn、b-Pparg、f-Ccl2、および f) の一元配置分散分析-Cxcl10) を使用して差異を評価しました。両側スチューデント t 検定を使用して (g) の差を評価しました。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

脂肪性肝炎とその合併症に対するLAPTM5の影響をさらに研究するために、肝細胞特異的Laptm5ノックアウトマウス（Laptm5-HKO）（補足図4a、b、および図4a）を構築し、通常の固形飼料（NC）またはHFD食で飼育しました。 24週間。通常の食餌を与えられた Laptm5-HKO マウスは、Laptm5-Flox マウスと比較して、体重、肝臓重量、または脂質プロファイルに差異を示さなかった。それにもかかわらず、HFD食の24週間後、Laptm5-HKOマウスは、対照群よりも高い肝臓重量、体重、空腹時血糖、肝臓および血清中のTG / TCレベルを示しました（図4b-h）。さらに、Laptm5-HKO マウスにおけるこれらの測定値は、Laptm5-Flox マウスと比較してさらに悪化しました。さらに、HFD給餌Laptm5-HKOマウスでは、より大きな肝臓と重度の脂質蓄積も観察され（図4i、j）、脂質の取り込み（Cd36）と合成に関連する遺伝子（Fasn、Scd1、Pparg、およびSrebf1）はアップレギュレートされています（図4k–m）。さらに、Laptm5-HKO マウスの肝臓は、対照と比較してアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）レベルが高いことから明らかなように、HFD食によりより重篤な損傷を受けました（図4n、o）。これらの発見により、Laptm5 の欠失が NAFLD の進行をさらに促進することが明らかになりました。

a Laptm5-HKO および Laptm5-Flox マウスの肝臓組織における LAPTM5 タンパク質レベル (n = 3 マウス/グループ)。 b NCまたはHFDを24週間摂取した後のLaptm5-HKOマウスおよびLaptm5-Floxマウスの体重。 c〜e NCまたはHFDを24週間摂取した後のLaptm5-HKOおよびLaptm5-Floxマウスの空腹時血糖（c）、肝臓重量（d）、体重に対する肝臓重量の比（LW / BW）（e）。 f – h 示されたグループのマウスの肝臓TG（f）、TC（g）、および血清TC（h）含量。 i 示されたグループのマウスの肝臓切片の肝臓（左、スケールバー、1 cm）、H&E（中央）、およびオイルレッド O（右）（スケールバー、100 μm）染色の巨視的および組織学的画像（n = 6匹のマウス/グループ）。 j NASスコア分析（左）およびオイルレッドO染色の統計分析（右）（n = 6マウス/グループ）。 k および l 示されたグループの肝臓における関連マーカーの相対 mRNA (n = 4 マウス/グループ) (k) およびタンパク質 (n = 3 マウス/グループ) (l) レベル。 m 示されたグループのマウスの肝臓切片における PPARγ の免疫組織化学的染色 (n = 6 マウス/グループ)。スケールバー、50μm。 n および o 示されたグループのマウスの血清 ALT および AST 濃度。 b-h および n、o、NC グループあたり n = 10 マウス、HFD グループでは n = 11 Laptm5-Flox マウス、および n = 10 Laptm5-HKO マウス。データは平均±SD、ns、有意ではないとして表されます。 (b–d、f–h、k-Scd1、k-Pparg、k-Srebf1、および n と o) については Tamhane T2 事後検定を使用した一元配置分散分析と、(e, k) についてはボンフェローニの事後分析による-Cd36 および k-Fasn)。(j - 左) のマン・ホイットニー U ノンパラメトリック統計検定と (j - 右) の両側スチューデント t 検定。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

NASH が NAFLD の進行期であることを考慮して、マウス NASH モデルにおける LAPTM5 の役割をさらに調査するために、Laptm5-Flox および Laptm5-HKO マウスに HFHC 食を 16 週間与えました。体重には差は見られなかったが、肝臓重量や空腹時血糖値などの脂質代謝指標と脂質沈着は、HFHC 給餌 8 週間後に HKO 群で悪化し、これらの指標は HFHC 給餌 16 週間後にさらに悪化した。 Flox グループとの比較（図 5a ～ f、および補足図 5a ～ d）。同時に、炎症性浸潤と肝線維症も、長期にわたるHFHC摂取により悪化しました（図5g–i、および補足図5e–i）。前述の所見と一致して、肝臓のLaptm5欠損はALTおよびASTの血清レベルを増強しました（図5j）。総合すると、これらの結果は、Laptm5 欠損が脂肪性肝炎とその代謝性合併症を大幅に悪化させることを実証しました。次に、配列決定のために HFHC 誘発 Laptm5-HKO および Flox マウスの肝組織から mRNA を抽出し、NASH における Laptm5 欠失後の 2 つのグループの遺伝子発現プロファイルを系統的に検査しました。 NASHでは、肝臓のLaptm5欠損が、脂質代謝、炎症、線維症を促進するさまざまな経路と遺伝子の上方制御を引き起こすことを発見しました（図5k-n）。

a NC または HFHC を摂取した Laptm5-HKO および Laptm5-Flox マウスの空腹時血糖値 (n = 10 マウス/グループ)。 bおよびc NCまたはHFHCを8週間または16週間給餌した後のLaptm5-HKOおよびLaptm5-Floxマウスの肝臓重量およびLW / BW（b）、および肝臓TG、TC含量（c）（n = 10マウス/グループ）。 d 示されたグループのマウスの肝臓切片における H&E (上) およびオイルレッド O (下) 染色 (n = 6 マウス/グループ)。スケールバー、100μm。 eおよびf 8週間または16週間のNCまたはHFHC給餌後のLaptm5-HKOおよびLaptm5-FloxマウスのNASスコア分析（e）およびオイルレッドO染色の統計分析（f）（n = 6マウス/グループ）。 g 示されたグループのマウスの肝臓切片における CD11b (赤) の免疫蛍光染色 (g) および統計分析 (h、i)。 (核、青色) (n = 4 マウス/グループ)。スケールバー、50μm。示されたグループのマウス肝臓切片の PSR 染色。 (8 週間、n = 6 マウス/グループ、16 週間、n = 7 Laptm5-Flox マウスおよび n = 5 Laptm5-HKO マウス)。スケールバー、100μm。 j 示されたグループのマウスの血清ALTおよびAST濃度（n = 10マウス/グループ）。 k HFHC食を与えたマウスからのRNA-seqデータの階層的クラスタリング分析。 l および m 脂質代謝、炎症、アポトーシス、および線維症に関連する経路の GSEA 経路濃縮分析。 n 示されたグループにおける脂質代謝、炎症反応、および線維症に関連する遺伝子のヒートマップ (赤、上方制御; 青、下方制御)。データは平均±SDとして表されます。 (c-8w、e-16w、および i-16w) ではマン・ホイットニー U ノンパラメトリック統計検定を統計分析に使用し、他のパネルでは両側スチューデント t 検定を使用しました。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

次に、NASH の不均一性を考慮して、メチオニンおよびコリン欠乏食（MCD）誘発マウス NASH モデルにおける LAPTM5 の役割を評価したところ、炎症性浸潤と肝臓損傷が実質的により重篤であることが判明しました 25。 HFHC誘発性NASHモデルの結果と一致して、Laptm5欠損は明らかにMCD食誘発性肝代謝障害と肝損傷を促進しました（補足図6a-g）。要約すると、Laptm5 の枯渇はマウスの NASH を悪化させます。

NASHの発症における肝臓Laptm5の役割を確認するために、同腹子（NTG）を対照として、肝細胞特異的Laptm5トランスジェニック（Laptm5-HTG）マウスモデル（補足図7aおよびb）を構築しました。 HTG マウスは肝臓重量および肝臓対体重比が低いことを示しましたが、HFHC 給餌 16 週間後の NTG マウスと比較して体重に有意な変化は観察されませんでした。 HFHCによって誘発される血糖値の上昇と脂質プロファイルの悪化も、Laptm5の過剰発現によって緩和されました（補足図7c-g）。さらに、HTG マウスは、NTG マウスよりも重度の肝脂肪症を示しませんでした（補足図 7h、i）。前述の所見と一致して、Laptm5の過剰発現は、NASH進行中の炎症、線維症、肝損傷を大幅に軽減しました（補足図7j–p）。まとめると、これらの発見は、LAPTM5 が脂肪性肝炎とその代謝性合併症から保護することを実証しました。

LAPTM5によるNASH防御の根底にある機構をさらに理解するために、RNA配列決定と京都遺伝子ゲノム百科事典（KEGG）経路解析の結果を統合し、Laptm5ノックアウトがMAPKシグナル伝達経路を最も大きく変化させることを発見した（図6a））。ウェスタンブロッティングにより、MAPKシグナル伝達経路はLaptm5の過剰発現によって抑制されるが、in vitroおよびin vivoの両方でLaptm5欠失によって増強されることが実証されました（図6b-e）。 MAPKシグナル伝達経路の抑制を媒介する特定の標的を同定するために、Laptm5を過剰発現するL02肝細胞に対してIP質量分析を実行し、LAPTM5が低分子GTP結合タンパク質CDC42（細胞分裂サイクル42）と相互作用することを発見しました（図6f）。、これは肝細胞における飽和脂肪酸刺激性 JNK 経路の主要な活性化因子として報告されていました 26。次に、CDC42の過剰発現が脂質蓄積、炎症反応を大幅に悪化させ、肝細胞のMAPKシグナル伝達経路の活性化を促進することを確認しました。この発見は以前に報告された結果と一致しています（補足図8a-e）。その後、LAPTM5とCDC42の間の相互作用はCO-IPおよびGSTアッセイによってさらに確認され（図6g、h）、さらに相互作用はPA刺激によりより強固でした（図6i）。さらに、Laptm5の過剰発現はPA刺激下でCDC42のタンパク質発現を阻害しましたが、BSA条件ではそのような効果はなく、結果はL02細胞と初代肝細胞の両方で検証されました（図6j、k）。一方、Laptm5ノックアウトはPA刺激下でCDC42発現を促進したが、これもBSA条件での結果と一致しなかった(図6l)。次に、NASH または非 NASH 個体の肝組織における CDC42 のタンパク質レベルをさらに調べたところ、NASH グループでは CDC42 発現が大幅に上方制御されていることがわかり、LAPTM5 と CDC42 が負の相関関係にあることが示唆されました（図 6m）。そして、NASH 調節軸は LAPTM5 と CDC42 の間に存在しました。 LAPTM5 媒介 CDC42 タンパク質分解の特異的経路を同定するために、LAPTM5 を過剰発現する細胞を MG132 または Chlq の両方で処理しました。我々は、リソソーム阻害剤ChlqがCDC42に対するLAPTM5の阻害効果を無効にすることができることを発見した（図6n、o）。リャンら。およびGuoら。らは、LAPTM5 が関連タンパク質のリソソーム分解を促進することにより、腫瘍や HIV などのさまざまな全身性疾患の進行を制御できることを実証しました。したがって、我々は、CDC42 の下方制御は LAPTM5 のリソソーム分解によって媒介されるという仮説を立てました。さらに、免疫蛍光共局在染色は、BSA条件下でCDC42が細胞質に均一に分布していることを示しました（補足図8f）。しかし、PA処理後、CDC42は徐々にリソソームに向かって移動し、顆粒状になり、最終的にLAPTM5を過剰発現する細胞内のリソソームと共局在するようになり、LAPTM5がCDC42のリソソームエンドサイトーシス輸送を促進し、リソソームによる分解を促進したことが示唆されました（図6p）。

a 結合 KEGG 分析結果は、最も濃縮された MAPK 経路を示しています。 bおよびcは、示されたグループのマウス肝臓におけるp38、JNK1 / 2、およびERK1 / 2のリン酸化レベルおよび総タンパク質レベルのウェスタンブロット画像（b）および定量的結果（c）（n = 3マウス/グループ）。データは平均±SDを表し、両側スチューデントt検定を使用して差を評価した。 dおよびeは、示されたグループの細胞におけるp38、JNK1/2、およびERK1/2のリン酸化レベルおよび総タンパク質レベルを示すウェスタンブロット画像。 f IP-MS分析によるLAPTM5と相互作用するタンパク質の同定スキーム。 g および h Co-IP (g) および GST プルダウン (h) は、LAPTM5 と CDC42 の間の相互作用を示します。 i PAの刺激後のLAPTM5とCDC42の間の結合強度の違いを調べるためのCo-IPアッセイ。 jおよびkは、異なる濃度のLAPTM5の過剰発現後の外因性(j)および内因性(k)のCDC42発現のウェスタンブロット結果。（l）PA刺激後のLAPTM5-KOマウスの肝細胞におけるCDC42発現のウェスタンブロット画像（上）および定量分析（下）（n = 3マウス/グループ）。データは平均±SDを表し、ボンフェローニ事後検定の一元配置分散分析を使用して差異を評価しました。 m NASHまたは非NASHのグループにおけるLAPTM5およびCDC42発現のウェスタンブロット画像（n = 5人/グループ）。 n ChlqまたはMG132処理下でのLAPTM5過剰発現後の外因性CDC42発現のウェスタンブロット結果。 o Chlq処理下での勾配におけるLAPTM5過剰発現を伴う外因性CDC42発現傾向のウェスタンブロット画像。 p 示されたグループ（核、青）のL02細胞におけるLAMP1（緑）とCDC42（赤）の共局在の共焦点顕微鏡画像。スケールバー、8 μm (n = 3 回の独立した実験)。 PAOA、0.5 mM/1.0 mM; PA、0.5 mM、OA、1.0 mM。Ｃｈ１ｑ、５０μＭ； MG132、50μM。イムノブロットは 3 つの独立した実験の代表です。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

次に、NASH 進行における LAPTM5-CDC42 調節軸の存在を検証しようとしました。我々は、Laptm5 を過剰発現する肝細胞において CDC42 の過剰発現を誘導しました。我々の結果は、CDC42の過剰発現により、CDC42が過剰発現された場合の好ましくない脂質プロファイルや上方制御されたMAPKシグナル伝達経路などの脂質代謝ストレスに対するLAPTM5の保護効果を取り除くことができることを示しました（図7a〜d）。それどころか、Laptm5がノックアウトされた場合、CDC42のノックダウンは肝細胞における脂質蓄積と炎症の悪化をうまく阻止しました（図7e-h）。まとめると、これらの結果は、LAPTM5 が CDC42 のタンパク質恒常性を媒介することにより、NASH において保護的な役割を果たしていることを示しています。

総ＪＮＫ１／２、リン酸化ＪＮＫ１／２、およびｏｖ発現後のｐ３８のウェスタンブロット分析により、Ｌ０２細胞におけるプラスミドが示された。 b〜d 示されたグループにおけるPAOA処理後のL02細胞のナイルレッド染色（b）およびTG含量（d）。スケールバー、25 μm (n = 3 回の独立した実験)。 e 示されたグループにおけるCDC42ノックダウンアデノウイルスに感染したLaptm5ノックアウト初代肝細胞のウェスタンブロット分析。 f – h 示されたグループにおけるPAOA処理後の初代肝細胞のナイルレッド染色（f）およびTG含有量（h）（n = 3の独立した実験）。 PAOA、0.5 mM/1.0 mM; PA、0.5 mM、OA、1.0 mM。Ｃｈ１ｑ、５０μＭ； MG132、50μM。データは平均±SDを表し、ボンフェローニ事後検定の一元配置分散分析を使用して、(c、d)および(g、h)の差を評価しました。イムノブロットは 3 つの独立した実験の代表です。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

最後に、NASH における LAPTM5-CDC42 軸を標的とした治療効果を調べました。 Laptm5 を過剰発現するアデノウイルス (AdLAPTM5) を、8 週間 HFHC 食を与えたマウスに注射しました。次に、マウスにさらに 4 週間 HFHC 食餌を与え、AdGFP を対照として使用しました (図 8a)。ウェスタンブロット分析により、AdLAPTM5処理マウスの肝臓においてLAPTM5が過剰発現され、p-JNK1/2およびCDC42の発現が下方制御されていることが確認された（図8b）。 AdGFPマウスと比較して、AdLAPTM5を注射したマウスは、空腹時血糖、肝臓重量、および肝臓重量対体重比が有意に減少していることを示した(図8c、d)。さらに、アデノウイルスを介したLaptm5の過剰発現は、HFHCを与えられたマウスの肝臓における脂質蓄積、炎症、肝損傷を大幅に改善しました（図8e-m）。総合すると、これらの発見は、LAPTM5 が NASH および代謝障害の治療標的として機能する可能性が高いことを強く示唆しました。

HFHCマウスにおけるAdLAPTM5媒介性NASH治療モデルの構築スキーム。 b グループに示されたタンパク質の WB 検出結果を表します (n = 3 マウス/グループ)。 c および d 示されたグループのマウスの空腹時血糖 (c)、肝臓重量、および LW/BW (d) (n = 10 マウス/グループ)。 e 示されたグループのマウスの肝臓のTGおよびTC含量（n = 10マウス/グループ）。 f 肝臓切片の H&E (上) (n = 6 マウス/グループ) およびオイルレッド O (下) (n = 5 マウス/グループ) 染色。スケールバー、100μm。 g パネル (f) のグループの NAS スコア分析 (n = 6 マウス/グループ)。 h パネルのグループにおけるオイルレッド O の統計分析 (f) (n = 5 マウス/グループ)。 i 示されたグループのマウスの肝臓における脂肪酸代謝に関連する遺伝子の相対 mRNA レベル (n = 6 マウス/グループ)。 jおよびk 示されたグループ（n = 5マウス/グループ）のHFHC給餌マウスの肝臓切片におけるCD11b（赤）の免疫蛍光染色（j）および統計分析（k）。スケールバー、50μm。 l 示されたグループのマウスの肝臓における炎症誘発性遺伝子の相対mRNAレベル（n = 6マウス/グループ）。 m 示されたグループのマウスの血清 ALT および AST 濃度 (n = 10 マウス/グループ)。データは平均±SDとして表され、両側スチューデントt検定を使用してすべてのパネルにおける差を評価した。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

我々の結果は、LAPTM5が代謝ストレス下でNEDD4Lによってユビキチン化分解される可能性があることを実証しました。 LAPTM5 の過剰発現は、肝脂肪症、炎症反応、および線維症を軽減しました。機構的には、LAPTM5 は CDC42 に直接結合し、そのリソソーム分解を促進し、c-Jun NH2 末端キナーゼシグナル伝達経路の活性化を阻害することで、その機能を果たします。肝細胞 LAPTM5 は、NASH の有望な治療標的です。

LAPTM5 は、ユビキチン相互作用モチーフ (UIM) と Nedd4-WW ドメインに結合する 3 つの PY モチーフを含む複数の膜貫通タンパク質です。同時に、NEDD4-LAPTM5複合体は、LAPTM5-UIM27に結合するユビキチン化GGA3をリクルートします。以前の研究では、E3 ユビキチンリガーゼ ITCH が LAPTM5 に結合し、ユビキチン化経路を通じて LAPTM5 を負に制御することが報告されました 28。私たちの研究では、NASH モデルでは LAPTM5 が大幅に減少しており、そのダウンレギュレーションはユビキチン - プロテアソーム経路を介していることが示されました。次に、NEDD4L および E3 ユビキチンリガーゼが LAPTM5 と相互作用し、LAPTM5 の K48 結合ユビキチン化を促進することを発見しました。したがって、NEDD4L-LAPTM5 の生理学的調節ループを標的とすることは、NASH を治療するための効果的な戦略となる可能性があります。

NASH の発症の根底にある分子機構は多因子的かつ複雑であり 29、複数の研究により、MAPK シグナル伝達経路が NASH の発症と進行に関与していることが示されています。高脂肪食は肝臓における JNK の発現を活性化する可能性があります 30。 NASH の細胞モデルでは、飽和脂肪酸 (パルミチン酸) が PPARα を活性化し、c-JNK 依存性のミトコンドリア機能不全と肝細胞死を引き起こしました 31。 P38 シグナル伝達経路は、炎症誘発性の細胞応答とストレス誘発性の細胞アポトーシスにおいて重要な役割を果たしています 32。グロワッカら。およびチェンら。 LAPTM5 が MAPK シグナル伝達経路の調節と活性化において重要な役割を果たしていることが証明されました 15,33。この研究では、分子研究と組み合わせたバイオインフォマティクス分析により、NASH モデルにおいて JNK1/2 と p38 の活性化が LAPTM5 過剰発現によって阻害されるが、LAPTM5 欠失によって増強されることが示されました。

さらに、最近の研究では、低分子 GTP 結合タンパク質 CDC42 が、MAPK シグナル伝達経路の活性化を調節することにより、NASH の発症に重要な役割を果たしていることが実証されました 34。 CDC42 の活性化は、肝細胞における SFA 刺激による MLK3 依存性の JNK 活性化に必要であり、CDC42 の発現低下は JNK26 の活性化を緩和する可能性があります。これらの発見と一致して、私たちの研究では、LAPTM5がCDC42と相互作用し、その発現を調節していることがわかりました。さらに、CDC42 の過剰発現により、脂質代謝に対する LAPTM5 の保護効果が消失しました。 LAPTM5 は主に、CDC42 の発現と MAPK シグナル伝達経路の活性化を制御することにより、NASH の進行を調節しました。

LAPTM5 と CDC42 の間の相互作用はまだ解明されていません。 LAPTM5 はリソソーム膜に局在し、幅広い病理学的および生理学的プロセスに関与しています。河合ら。 LAPTM5 がリソソーム転座と CD3ζ14 の分解を促進することを報告しました。大内田ら。らは、LAPTM5 が BCR と相互作用し、マウス B 細胞におけるそのリソソーム分解を促進することを実証しました 35。一方、いくつかの最近の研究では、LAPTM5 が関連タンパク質のリソソーム分解を促進することにより、悪性腫瘍や HIV などの一部の全身状態の進行を制御できることが実証されました 36,37。さらに、リソソーム分解経路も NASH の進行に重要な役割を果たします。以前の研究では、TMBIM1 が TLR4 のリソソーム分解を促進し、高脂肪食誘発性のインスリン抵抗性、脂肪肝、炎症を抑制することが証明されています 38。本研究では、LAPTM5 が PA の刺激下で CDC42 のリソソーム局在化と分解を促進できることを発見しました。ただし、CDC42 の発現と局在は、BSA 条件下では影響を受けませんでした。これは、LAPTM5 と CDC42 の間の相関関係が PA の治療後に変化した可能性があることを示しています。たとえば、PA刺激後にLAPTM5およびCDC42のタンパク質ドメインおよび分子活性に何らかの変化が生じる可能性があります。ヨンシルら。 LAPTM5 のタンパク質輸送および選別機能は、そのさまざまなドメインによって厳密に制御されていると報告しました 27。マンジュら。らは、CDC42 の活性化が疾患進行の制御に重要な役割を果たしており、CDC42 の活性強度もその生物学的機能に影響を与えることを報告しました 26。したがって、PA刺激後、細胞内には繊細かつ複雑な変化が生じている可能性があります。そして、これらの根深いメカニズムについてはさらなる研究が必要です。

要約すると、この研究では、肝細胞における CDC42 リソソーム分解を促進することにより p38/c-JNK 経路を負に制御する可能性がある、報告されていない NASH のサプレッサーとして LAPTM5 を同定しました。私たちの研究では、アデノウイルス媒介Laptm5療法がNASHに対して有効であり、LAPTM5タンパク質の発現がNASHの臨床進行と相関していることが示されました。これらの発見は、肝細胞特異的 Laptm5 を標的とすることが NASH 治療の有効な代替療法となり得ることを示しており、さらなる前臨床研究に値するものである。

NASH の治療における LAPTM5 の役割に関するいくつかの疑問はまだ答えられていません。たとえば、LAPTM5 はどのようにして CDC42 をリソソームに運び、そのタンパク質を分解するのでしょうか。具体的にはそのプロセスはどのように行われるのでしょうか? CDC42 は下流の p38 および JNK1/2 経路の活性をどのように調節するのでしょうか? これらすべての問題は、さらなる調査を必要とします。さらに、LAPTM5 と NASH との相関関係は、大規模な臨床試験によってさらに検証される必要があります。私たちの実験はマウスで行われたが、臨床試験に進む前に霊長類などのより大型の動物のNASHモデルを使った研究が必要である。

この研究で使用される主要な試薬、抗体、およびプライマーは補足資料にリストされています。

この研究で概説されているすべての動物管理および関連実験は、米国国立衛生研究所によって起草された実験動物の管理と使用のガイドライン (NIH 出版物、第 8 版、2011 年) に従って実行されました。同済医科大学と華中科学技術大学の施設内動物管理使用委員会は、この研究で使用される動物プロトコルを承認しました。

体重 22 ～ 30 g の生後 8 ～ 10 週齢の成体 C57BL/6 雄マウスを、温度 22 ～ 24 °C、湿度 40 ～ 70% に制御された環境で病原体が存在しない条件下で飼育しました。 12時間の明暗サイクル、水と餌は自由摂取。脂肪肝モデル HFHC (脂肪 42%、脂肪 60%、炭水化物 20%、H10060、Beijing HUAFUKANG Bioscience Co., Ltd) を 24 週間投与する前は、マウスの健康状態は概して良好でした。 44% 炭水化物、14% タンパク質、0.2% コレステロール; TP26304; Trophic Diets、南通、中国) 食を 16 週間、MCD (TP3005G; Trophic Diets、南通、中国) 食を 4 週間実施して、NASH モデルまたは NCD (タンパク質、18%、脂肪、4%、炭水化物、78%、1010001、江蘇省、中国）、および MCS（TP3005GS、Trophic Diets、南通、中国）。頸椎脱臼はマウスの安楽死に利用されました。すべての動物は同済医科大学の実験動物資源部門で給餌および飼育されました。

ヒトサンプルの収集と適用は、倫理番号WDRY2018-K001を持つ武漢大学人民病院の倫理委員会の監督下で実施され、ヘルシンキ宣言の原則に準拠した。すべての個人は、本研究における臨床検体の使用についてのインフォームドコンセントに署名しています。

我々は、肝生検または肝移植を受けた単純性脂肪症またはNASHの患者からヒト脂肪肝サンプルを入手しました。非脂肪肝サンプルは、肝嚢胞または肝血管腫による肝切除を受けたドナーの肝臓の健康な領域から採取されました。この研究に登録された個人は、肝炎ウイルス感染、薬物乱用、または過剰なアルコール摂取（週あたり男性で 140 g 以上、女性で 70 g 以上）から除外されました。患者の肝臓サンプルは、非 NASH グループ 16 名と NASH グループ 20 名から採取されます。非 NASH グループには、27 歳から 67 歳までの年齢範囲の女性患者 9 人、男性患者 7 人がいます。 NASH グループには、19 歳から 40 歳までの年齢範囲の女性患者 13 人、男性患者 7 人がいます。

Laptm5-flox マウスは、CRISPR/Cas9 システムを使用して C57BL/6 バックグラウンドで生成されました。 Laptm5 イントロン 1 および 2 を標的とする 2 つのシングルガイド RNA (sgRNA) (表 S1 にリストされている) は、オンライン CRISPR 設計ツール (http://chopchop.cbu.uib.no/) を使用して設計されました。 sgRNA 発現ベクターは、pUC57-sgRNA バックボーン (Addgene、51132) を使用して構築されました。また、相同組換え修復のために、2 つの相同アーム、中間コード領域 (CDS)、および同じ方向の 2 つの loxP 配列を含むドナーベクターも設計しました。次に、sgRNA および Cas9 発現ベクター (Addgene、44758) を in vitro で転写し、in vitro で得られた mRNA とドナーベクターの混合物を、マイクロインジェクション装置を使用してマウスの接合子に注入しました。次に、注入された接合子をレシピエントマウスの子宮に移植し、遺伝子型解析によって Laptm5-flox マウスを取得しました。続いて、Laptm5-flox/flox マウスが得られるまで創始者マウスを C57BL/6 マウスと交配させ、肝臓特異的 Alb-Cre トランスジェニックマウス (JAX、003574) と交配させました。 Laptm5-flox/flox/Alb Cre マウス (Laptm5-HepKO) をスクリーニングしました。使用した識別プライマーを表 P1 ～ P5 に示します。

逆転写により得られたマウスcDNAからLaptm5のCDS領域を増幅し、pALB過剰発現ベクターを構築した。正しく配列決定されたプラスミドは、PvuI 制限エンドヌクレアーゼによって直線化されました。回収された断片は精製され、マイクロインジェクションに使用され、その後、F0 世代のマウスが取得および同定されました。最初の陽性マウスを野生型と交配し、F1 世代の陽性マウスを交配用に選択して、安定な遺伝的肝臓特異的 Laptm5 トランスジェニックマウス系統を取得しました。使用したプライマーを表 S3 に示します。

初代肝細胞は、生後 6 ～ 8 週の雄 C57BL/6 マウスから単離されました。簡単に説明すると、マウスに麻酔をかけ、腹腔を開いた。肝臓が黄色になるまで、下肝大静脈を洗浄液で灌流した。最後に、0.05% IV コラゲナーゼを含む洗浄溶液を使用して肝臓を消化しました。次いで、肝臓を取り出し、マイクロ鉗子を用いて肝臓被膜を開いた。次に、組織を100μmのセルストレーナーで濾過して初代肝細胞を得、これを50×gで3分間遠心分離し、50%パーコール溶液で精製した。精製した初代肝細胞を、10% ウシ胎児血清および 1% ペニシリン - ストレプトマイシンを含む DMEM 中で、5% 二酸化炭素/水飽和インキュベーター内で 37 °C で培養しました。

ヒト肝細胞 L02、ヒト胎児腎臓 293、および 293T 細胞株は、中国科学院 (中国、上海) の Type Culture Collection から購入しました。すべての細胞株のマイコプラズマ汚染を検査したところ、結果は陰性でした。細胞は、10% ウシ胎児血清および 1% ペニシリン - ストレプトマイシンを含む DMEM 中で、5% 二酸化炭素/水飽和インキュベーター内で 37 °C で培養されました。実験前に、すべての細胞株がショートタンデムリピート DNA プロファイリングによって検証されました。私たちの研究室のすべての細胞株は、蘇生後30回以内に継代され、PCRによってマイコプラズマ汚染について定期的に検査されました。 in vitro で脂肪肝モデルを確立するために、マウス初代肝細胞と L02 細胞をパルミチン酸 (PA; 0.5 mM; P0500; Sigma-Aldrich; セントルイス、ミズーリ州、米国) およびオレイン酸 (OA; 1.0 mM; O) で刺激しました。 -1008; Sigma-Aldrich; セントルイス、ミズーリ州、米国）（0.5% 脂肪酸を含まない BSA に溶解）記載の濃度で 12 ～ 24 時間。対照群では、細胞を脂肪酸を含まないBSA（0.5%; BAH66-0100; Equitech Bio、米国テキサス州カービル）で刺激しました。 LAPTM5がCDC42のプロテアソーム分解を促進するかどうかを決定するために、細胞を50μmol/LのChlq (S6999; Selleck Chemicals)で12時間処理した。

マウスの空腹時血糖値と体重レベルを 4 週間ごとに評価し、空腹時血糖値をグルコメーター (Life Scan、ミルピタス、カリフォルニア州、米国) を使用して測定しました。血清 TC、ALT、および AST 濃度は、ADVIA 2400 Chemistry System Analyzer (Siemens、米国ニューヨーク州タリータウン) を使用して、製造元の指示に従って測定しました。

初代肝細胞、L02 細胞、肝組織の TG および TC 含量 (TG については 290-63701、TC については 294-65801; Wako; Tokyo, Japan) を、製造業者の指示に従って市販のキットを使用して測定しました。

マウスの肝臓組織を 10% ホルムアルデヒドで 48 時間固定し、その後組織ブロックを切り取り、組織脱水により包埋しました。 OCT 包埋肝臓切片はオイルレッド O (O0625; Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, USA) で染色し、パラフィン包埋肝臓切片は H&E (Hematoxylin, G1004, Servicebio, Wuhan, China; Eosin) で染色しました。、BA-4024、Baso、珠海、中国）およびピクロシリウスレッド（PSR; 26357-02; Hede biotechnology、北京、中国）、これらは肝線維症検査に使用されました。すべての組織学的画像は、光学顕微鏡 (ECLIPSE 80i、Nikon、東京、日本) を通じて取得されました。

PPARγ および CD11b 発現を分析するための免疫組織化学は、PPARγ (1:400 希釈、2435T、Cell Signaling Technology)、CD11b (1:4000 希釈、BM3925、Boster、武漢、中国) を使用してパラフィン包埋肝臓切片 (5 μm) で実施されました。 LAPTM5 (1:200 希釈、sc134676、Santa Cruz) 抗体。抗原賦活化のために、サンプルを圧力鍋でpH6.0のクエン酸塩組織抗原賦活化溶液中で5分間加熱した。冷却後、サンプルを 3% H2O2 中に 20 分間置き、内因性過酸化物の活性を抑えました。次いで、スライドをＰＢＳで洗浄した後、１０％ＢＳＡで３０分間ブロックした。続いて、切片を一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートし、PBS で 3 回 (5 分/洗浄) 洗浄した後、切片をウサギ 2 段階検出キット (PV-9001、ZSGB-BIO、北京、中国) に従ってインキュベートしました。メーカーのプロトコル。免疫組織化学的染色は、3,3'-ジアミノベンジジン (DAB) 基質キット (ZLI-9018; ZSGB-BIO、北京、中国) およびヘマトキシリン対比染色を使用して視覚化しました。画像は光学顕微鏡 (ECLIPSE 80i、Nikon、東京、日本) を使用して取得されました。

CD11b 免疫蛍光染色を実行するには、抗原賦活化後、肝臓組織のパラフィン切片を最初に抗 CD11b (1:800 希釈、BM3925、Boster、中国武漢) 一次抗体で 4 °C で一晩標識し、次に蛍光団とインキュベートしました。 -結合二次抗体 [Alexa Fluor 568 ヤギ抗ウサギ IgG (H + L); A11036; インビトロジェン; カールスバッド、カリフォルニア州、米国] 37 °C で 1 時間。免疫蛍光画像は、蛍光顕微鏡 (BX51; オリンパス、東京、日本) を通じて取得されました。

L02 細胞とマウス初代肝細胞を PAOA で 0、12、または 24 時間処理しました。続いて細胞を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、ナイルレッド（ＰＢＳ中１ｍＭ；２２１９０；ＦａｎｂｏＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；北京、中国）で染色した。脂質の蓄積は、レーザー走査型共焦点顕微鏡（TCS SP8; Leica、Wetzlar、ドイツ）またはハイコンテント分析システム（Operetta CLS、Waltham、MA、USA）を使用して視覚化および定量化されました。

カバースリップ染色では、関連プラスミドをトランスフェクトした L02 肝細胞をマウス抗 LAMP1 抗体およびウサギ抗 CDC42 抗体とともに 37 °C で 2 時間インキュベートし、その後蛍光標識二次抗体で標識しました。すべての画像の核は DAPI (S36939; Invitrogen; Carlsbad, CA, USA) で染色され、画像は共焦点レーザー走査顕微鏡 (TCS SP8; Leica; Wetzler, Germany) で取得されました。色素をロードする前に、Chlq (50 μM) の存在下で細胞を PA (0.5 mM) で 12 時間処理しました。

リソソーム膜貫通タンパク質の PCR 産物を cDNA ライブラリーから取得し、対応するベクターにクローニングして過剰発現プラスミドを取得しました。ヒト LAPTM5、NEDD4、WWP2、ITCH、CDC42 コード領域の全長配列を pcDNA5-HA、pcDNA5-Flag、pcDNA5-Myc、pcDNA5-GST-HA ベクターにサブクローニングして、Flag-LAPTM5、HA-NEDD4、HA を生成しました。 -WWP2、HA-ITCH、Myc-CDC42、GST-HA-LAPTM5、およびGST-HA-CDC42組換えプラスミド。同様に、ヒトNEDD4Lの全長配列をpcDNA3.1-HAベクターに挿入してHA-NEDD4Lを生成し、HA-NEDD4L(C943S)を増幅した。レンチウイルスパッケージシステムは、2 つのパッケージングプラスミド、pMD2.G および psPAX2、および標的ファージ-Flag-LAPTM5 プラスミドで構成されていました。これらを混合して集めて、HEK 293 T 細胞に感染させました。感染の 48 時間後、HEK 293 T 細胞の上清を収集し、ポリブレン (8 μM; H9268; Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国) で L02 細胞を感染させ、トランスフェクションを補助しました。プロマイシン (A1113803; Gibco、米国ニューヨーク州グランドアイランド) を使用して LAPTM5 過剰発現安定細胞株を生成し、レンチウイルス緑色蛍光タンパク質 (lenti-GFP) を対照として使用しました。

シャトルプラスミド pENTR-U6-CMV-flag-T2A-EGFP および ViraPower アデノウイルス発現システム (V493-20; Invitrogen; 米国カリフォルニア州カールズバッド) を使用して、マウス LAPTM5 過剰発現アデノウイルスベクターを生成しました。 PacI (R0547L; NEB、マサチューセッツ州、米国) で直線化した後、アデノウイルスベクターを、ポリエチレンイミン (24765-1; Polysciences、英国ウォリントン、英国) トランスフェクション試薬を使用して 293 細胞にトランスフェクトしました。 6 ～ 7 日後に細胞を回収して、最初のアデノウイルスを取得しました。 3 世代の増幅後、LAPTM5 アデノウイルスを塩化セシウム密度勾配遠心分離によって精製し、50% 組織培養感染量 (TCID50) 法を使用して力価を測定しました。マウス初代肝細胞を感染多重度（MOI）50でアデノウイルスに感染させた。in vivoアッセイでは、マウスLAPTM5タンパク質またはGFPを発現するアデノウイルス（HANBIO（中国、上海）から購入）をHFHC摂取の8週間後に腹腔内に注射した。

RIPA 溶解バッファーによって動物の組織または細胞から総タンパク質を単離および溶解し、Pierce BCA タンパク質アッセイキット (23225、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用してタンパク質を定量しました。等量の示されたタンパク質を 10% SDS-PAGE ゲルにロードし、PVDF メンブレンに転写しました。続いて、PVDF 膜を TBST に溶解した 5% スキムミルクでブロックし、対応する一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートし、続いて HRP 結合二次抗体とともに 1 時間インキュベートしました。次に、ECL キットを使用してタンパク質を検出し、ChemiDoc XRS+ イメージングシステムを使用して視覚化しました。

TRIzolを用いて動物組織および培養細胞から全mRNAを抽出し、Vazymeの逆転写試薬を用いてcDNAを調製した。メーカーの指示に従ってSYBR Greenを使用してqPCRを実施しました。関連遺伝子の mRNA 発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子 β-アクチンの mRNA 発現レベルに対して正規化されました。

免疫沈降 (IP) を実行して、タンパク質間の相互作用を検出しました。簡単に言うと、HEK293T または L02 細胞を指定のプラスミドで同時トランスフェクトしました。約 16 ～ 24 時間のトランスフェクション後、プロテアーゼ阻害剤を含む氷冷 150 mM IP 溶解バッファー (20 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、および 1% NP-40) を使用して細胞を溶解しました。カクテル（04693132001; Roche; バーゼル、BS、スイス）。遠心分離 (12,000 × g、10 分間) 後、上清を新しい EP チューブに収集しました。続いて、各サンプルをプロテイン A/G アガロースビーズ (AA104307; Bestchrom; 上海、中国) と 1 時間インキュベートし、次に指定の抗体と 4 °C で一晩インキュベートしました。遠心分離（３５００×ｇで５分間）後、ビーズを３００ｍＭＩＰ溶解緩衝液で３回、１５０ｍＭＩＰ溶解緩衝液で２回洗浄した。最後に、ビーズを SDS ローディングバッファー中で 95 °C で 15 分間加熱し、ウェスタンブロッティングのために SDS-PAGE で分離しました。

示されたプラスミドでコトランスフェクトされたL02細胞を80μLの150mM IP溶解バッファーおよび10μLの10％SDS溶解バッファーで溶解し、次いで95℃で15分間加熱することによって変性させた。加熱後、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む900μLの150mM IP溶解緩衝液を溶解物に添加した。超音波処理と遠心分離 (12,000 × g、15 分間) の後、上清を収集し、指定の抗体およびプロテイン A/G アガロースビーズとともに 4 °C で 3 時間インキュベートしました。遠心分離（3500 xgで5分間）後にビーズを取り出し、500 mM IP溶解緩衝液（20 mM Tris-HCl、pH 7.4、500 mM NaCl、1 mM EDTA、および1% NP-40）で3回洗浄しました。次に、ビーズを SDS ローディングバッファーとともに 95 °C で 15 分間加熱し、前述のようにウェスタンブロッティングのために SDS-PAGE によって分離しました。

異なるグループ間の遺伝子発現差を分析するために、全 mRNA が抽出され、逆転写によって cDNA ライブラリーが構築されました。シングルエンドライブラリーは、BGISEQ 500 (MGI Tech、深セン、中国) を使用して配列決定されました。 HISAT2 ソフトウェア (バージョン 2.1.0) を使用して、リードを Ensembl マウス (mm10/GRCm38)/ヒト (hg38/GRCh38) 参照ゲノムにマッピングしました。バイナリアライメントマップ (BAM) ファイルは SAMtools (バージョン 1.4) を通じて生成され、遺伝子の 100 万マッピングフラグメントあたりのエクソンモデルのキロベースあたりのフラグメント (FPKM) 値は StringTie (バージョン 1.3.3b) を使用して計算されました。 DESeq2 (バージョン 1.2.10) を差次的遺伝子発現解析に使用しました。倍率変化が 1.5 を超え、対応する調整 P 値が 0.05 未満の遺伝子を DEG として同定しました。

非加重平均距離アルゴリズムを使用して、階層的クラスタリング分析用のクラスタリングツリーを生成しました。各生物学的複製の遺伝子発現レベルは、Z スコア法を使用して正規化されました。

すべての KEGG 経路または GO 生物学的プロセス用語および関連する遺伝子は遺伝子セットとして定義され、Java GSEA を使用して GSEA を実装するために、「Signal2Noise」メトリクスを使用してランク付けされたリストと「遺伝子セット」順列タイプが生成されました (バージョン 3.0) プラットフォーム。

社内の R スクリプトを使用してフィッシャーの正確検定を使用して KEGG 経路エンリッチメント分析を実行し、KEGG データベースから KEGG 経路アノテーションをダウンロードしました。同時に、P 値 <0.05 の経路を、有意に濃縮された経路として定義しました。

IP アッセイで免疫沈降された LAPTM5 とその相互作用タンパク質について説明しました。タンパク質を液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析 (LC-MS/MS) 分析に供しました。候補分子を選択するための基準は以下の通りであった：（１）候補分子はＰＡＯＡ処理群には存在しなければならないが、ＢＳＡ処理群では減少しなければならない：（２）固有のペプチドの数は＞２でなければならない。

すべてのデータは、SPSS 21.0 ソフトウェアを使用して、対応する統計手法を通じて分析されました。正規分布を持つ 2 つのグループ間の差異は、スチューデントの t 検定を使用して決定されました。正規分布を持つ 3 つ以上のグループ間の比較では、一元配置 ANOVA に続いて、Bonferroni 事後検定 (分散の均一性を示すデータの場合) または Tamhane T2 事後検定 (不均一分散データの場合) を適用しました。データが非正規分布に該当する場合は、Kruskal-Wallis ノンパラメトリック統計検定が使用されました。統計的有意性は P < 0.05 に設定されました。すべてのデータは平均値 ± SD 値として示されており、データの対応する P 値とともに使用された統計的手法は各図の凡例に記載されています。私たちは動物実験から盲検法でデータを収集し、最終的な統計分析から除外されたデータはありませんでした。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成された RNA 配列データは、アクセッションコード PRJNA918313 (ID 918313 - BioProject - NCBI (nih.gov)) および PRJNA918311 (ID 918311 - BioProject) として国立バイオテクノロジー情報センターの配列読み取りアーカイブ (SRA) データベースに寄託されています。 - NCBI (nih.gov))。臨床的 NASH 患者および健康または健康な肥満患者のヒト肝臓の RNA 配列の処理データ (アクセッション番号: GSE66676、GSE63067、GSE61260、GSE48452、GSE162694_F4、GSE162694_F3、GSE162694_F2、GSE162694_F1、GSE162694_F) 0、GSE130970)、肝臓の RNA 配列マウス NASH のサンプル (アクセッション番号: GSE93819、GSE57290_68W、GSE57290_38W、GSE53381、GSE51432) は、Gene Expression Omnibus (GEO) データベースから収集されました。この研究の結果を裏付ける他のすべてのデータは、記事とその補足情報ファイルおよび補足表内で入手できます。この記事のレポート概要は、補足情報ファイルとして入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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Hao Zhang 博士 (華中科学技術大学同済医科大学ユニオン病院) とシャンシャン・チェン (華中科学技術大学同済医科大学武漢中央病院) の技術的援助と精神的な励ましに感謝します。。この研究は、中央大学の基礎研究基金 (HUST No. 2021GCRC037) および中国国立自然科学財団 (81730015、82170504、81974048) からの助成金によって支援されました。

Lang Jiang、Jing Zhao、Qin Yang、Mei Li の著者も同様に貢献しました。

心臓血管外科、ユニオン病院、同済医科大学、華中科学技術大学、430022、武漢、中国

ラン・ジャン、ハオ・リウ、シャオユエ・シャオ、ペイウェン・ヤン、ジアホン・シア

心臓病科、武漢中央病院、華中科学技術大学同済医科大学、430014、武漢、中国

ジン・ザオ、マンファ・チェン、ピン・イェ

心臓病科、黄崗中央病院、438021、黄崗、中国

チン・ヤン

武漢大学基礎医科学部、430071、武漢、中国

メイリー、ソンティアン、シャフー

武漢大学人民病院心臓病科、430060、武漢、中国

ジェン・リウ

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P.イェー。 JX が実験を設計しました。 LJ、JZ、QY、ML が実験、データ分析を実行し、原稿を執筆しました。 ST、SH、ZL はバイオインフォマティクス分析を実行しました。 HL、XX、P.Yang。技術サポートを提供しました。 MCからはアドバイスやコメントもいただきました。 P.Ye.、MC、JX がこの研究を企画、監督しました。

Manhua Chen、Ping Ye、Jiahong Xia への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Pablo Muriel と他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Jiang、L.、Zhao、J.、Yang、Q. 他。リソソーム関連タンパク質膜貫通 5 は、マウスの CDC42 の分解を促進することにより、非アルコール性脂肪性肝炎を改善します。 Nat Commun 14、2654 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-37908-9

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受信日: 2022 年 9 月 14 日

受理日: 2023 年 4 月 5 日

公開日: 2023 年 5 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37908-9

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